软坚清脉颗粒质量标准研究*

黄雨婷，胡鹏跃，李国文，史秀峰，谢燕

（上海中医药大学，上海 201203）

软坚清脉颗粒由垂盆草、蒲黄、豨莶草、海藻、煅牡蛎5味药材配伍，具有软坚散结、祛瘀消肿功效，临床用于治疗肢体动脉粥样硬化斑块形成引起的肢体血管狭窄、闭塞导致下肢慢性缺血的外周动脉疾病等［1］。该制剂现行制备工艺规范性欠佳，且质量标准较低，不能满足临床需求。槲皮素、山柰素、异鼠李素为垂盆草主要成分，香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷为蒲黄主要成分，均具有多种药理学活性［2-6］。本研究中采用薄层色谱（TLC）法鉴别该制剂中垂盆草、蒲黄、豨莶草，并建立了同时测定垂盆草中槲皮素、山柰素、异鼠李素及蒲黄中香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷含量的高效液相色谱（HPLC）法，以期为软坚清脉颗粒的质量控制提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；CP225D型十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司）；ATS4型薄层点样仪、Visalient型薄层成像仪（瑞士CAMAG公司）；SK7200LHC型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试药

软坚清脉颗粒（上海练塘药业有限公司，批号分别为210112，211001，211002，211003）。槲皮素对照品（批号为100081-201610，含量98%）、山柰素对照品（批号为110861-201611，含量98%）、异鼠李素对照品（批号为110860-201611，含量98%）、香蒲新苷对照品（批号为111573-201405，含量98%）、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品（批号为111571-201205，含量98%）、垂盆草对照药材（批号为121434-201203）、蒲黄对照药材（批号为121225-201804）、豨莶草对照药材（批号为121572-201202），均购自中国食品药品检定研究院；奇壬醇对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号为MUST-18051504，含量98%）；硅胶G薄层板（烟台市化学工业研究所，批号为20201107）；磷酸、乙腈、甲醇均为色谱纯；三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、甲酸、正丁醇、环己烷、乙醚均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

垂盆草：取样品粉末10 g，加甲醇20 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz；下同）处理30 min，滤过，蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，即得供试品溶液；取垂盆草对照药材1 g，同法制得对照药材溶液；按软坚清脉颗粒处方及工艺制备缺垂盆草的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以环己烷-乙酸乙酯（15∶1，V/V）为展开剂，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 A。

蒲黄：取样品粉末10 g，加水30 mL，超声处理30 min，滤过，用乙醚萃取，弃去乙醚液，水浴挥去残留乙醚，加水饱和的正丁醇萃取，取正丁醇层蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，即得供试品溶液。取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解制成质量浓度均为1 mg/mL的单一对照品溶液；取蒲黄对照药材1 g，同法制得对照药材溶液；按软坚清脉颗粒处方及工艺制备缺蒲黄的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（4∶3∶1∶1，V/V/V/V）为展开剂，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，与对照药材溶液、对照品溶液色谱相应位置上显相同斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 B。

豨莶草：取样品粉末10 g，加70%甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，即得供试品溶液。取奇壬醇对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液；取豨莶草对照药材1 g，同法制得对照药材溶液；按软坚清脉颗粒处方及工艺制备缺豨莶草的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）为展开剂，喷以5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液、对照品溶液色谱相应位置上显相同斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 C。

图1 薄层色谱图1.Reference medicinal materials solution 2.Negative reference solution 3-5.Test solution 6.Typhaneoside reference solution 7.Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside reference solution 8.Kirenol reference solution A.Sedi Herba B.Typhae Pollen C.Siegesbeckiae HerbaFig.1 TLC chromatograms

2.2 垂盆草有效成分含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸K溶液（44∶56，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30℃；进样量：10μL［7］。

2.2.2 溶液制备

取槲皮素、山柰素、异鼠李素对照品各适量，分别加甲醇制成单一对照品溶液；另取3种对照品各适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为15，5，5μg/mL的混合对照品溶液。取样品粉末4 g，精密称定，分别精密加入甲醇20 mL及20%盐酸5 mL，精密称定质量，80℃回流45 min，冷却至室温，加甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液及2.1项下缺垂盆草的阴性对照品溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液与混合对照品溶液色谱分别于28，55，64 min时出现相应色谱峰，且阴性对照无干扰；二极管阵列检测器纯度分析显示，主峰的纯度因子分别为989，998，999，均大于980，分离度均大于1.5，表明专属性良好。详见图2。

图2 垂盆草高效液相色谱图1.Quercetin 2.Kaempferol 3.IsorhamnetinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of Sedi Herba

线性关系考察：分别取3种对照品各适量，精密称定，加甲醇稀释，制成槲皮素质量浓度分别为83.2，62.4，41.6，20.8，10.0μg/mL，山柰素分别为16.0，12.0，8.0，4.0，2.0μg/mL，异鼠李素分别为44.8，33.6，22.4，11.2，5.6μg/mL的系列单一对照品溶液。取10μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。分别以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y1=4 292.4X1-40.81（r=0.999 6）、Y2=3 835.6X2-11.34（r=0.999 3）、Y3=4 269.1X3-46.36（r=0.999 6）。结果表明，槲皮素、山柰素、异鼠李素质量浓度分别在10.0～83.2μg/mL、2.0～16.0μg/mL、5.6～44.8μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限和检测限考察：取2.2.2项下混合对照品溶液适量，用甲醇倍比稀释，以信噪比（S/N）为10∶1和3∶1时的质量浓度分别记为定量限和检测限。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的定量限分别为9.40，21.36，21.08 ng，检测限分别为2.81，6.41，6.30 ng。

精密度试验：取2.2.2项下混合对照品溶液适量，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为0.74%，0.57%，0.88%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2.2项下供试品溶液（批号为210112）适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为3.29%，4.56%，3.94%（n=8），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品粉末（批号为210112）适量，各6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果槲皮素、山柰素、异鼠李素的平均含量分别为269.40，55.48，112.60μg/g，RSD分别为2.59%，1.21%，3.35%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品粉末（批号为210112）2 g，精密称定，各6份，分别加入2.2.2项下一定质量浓度的单一对照品溶液，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。

表1 槲皮素、山柰素、异鼠李素的加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test of quercetin，kaempferol and isorhamnetin（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取各批样品适量，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（±s，μg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of five components in the samples（±s，μg/g，n=3）

表2 样品含量测定结果（±s，μg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of five components in the samples（±s，μg/g，n=3）

批号210112 211001 211002 211003槲皮素269.40±2.49 430.36±1.59 419.37±2.36 437.72±15.02山柰素55.48±0.54 87.48±0.68 85.70±0.37 88.10±3.39异鼠李素112.60±0.95 159.31±0.41 155.61±0.36 167.59±8.20香蒲新苷140.89±4.60 179.92±2.03 178.73±2.49 181.91±1.84异鼠李素-3-O-新橙皮苷82.82±4.18 120.53±5.00 121.62±4.80 126.55±3.08

2.3 蒲黄有效成分含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸水溶液（14∶86，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：10μL［2］。

2.3.2 溶液制备

取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷对照品各适量，加甲醇制成质量浓度均为50μg/mL的混合对照品溶液。取样品粉末4 g，加75%甲醇50 mL，精密称定，超声处理45 min，冷却至室温，加75%甲醇补足减失的质量，滤过，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.3.2项下混合对照品溶液、供试品溶液及2.1项下缺蒲黄的阴性对照品溶液各适量，按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液与混合对照品溶液色谱在28 min及42 min时出现相应色谱峰，且阴性对照无干扰；二极管列阵检测器纯度分析显示，主峰的纯度因子分别为989，992，均大于980，分离度均大于1.5，表明专属性良好。详见图3。

图3 蒲黄高效液相色谱图1.Typhaneoside 2.Isorhamnetin-3-O-neohesperidosideA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Typhae Pollen

线性关系考察：取2种对照品各适量，精密称定，分别用甲醇稀释，制成香蒲新苷质量浓度分别为41.2，33.0，24.7，16.5，8.2，4.1μg/mL，异鼠李素-3-O-新橙皮苷分别为42.4，33.9，25.4，17.0，8.5，4.2μg/mL的系列单一对照品溶液，取适量，按2.3.1项下色谱条件进样测定。以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y4=1 455.1X4+16.16（r=0.999 8）、Y5=1 992.0X5+18.85（r=0.999 8）。结果表明，香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷质量浓度分别在4.1～41.2μg/mL、4.2～42.4μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限和检测限考察：取2.3.2项下混合对照品溶液适量，用75%甲醇倍比稀释，以S/N为10∶1，3∶1时的质量浓度分别记为定量限和检测限。结果香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷的定量限分别为20.24 ng，20.48 ng，检测限分别为6.88 ng，6.96 ng。

精密度试验：取2.3.2项下混合对照品溶液适量，按2.3.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.41%，0.36%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.3.2项下供试品溶液（批号为210112）适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h时按2.3.1项下色谱条件进样测定。结果香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面积的RSD分别为2.11%，4.36%（n=8），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品粉末（批号为210112）适量，各6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮苷的平均含量分别为140.89μg/g，82.82μg/g，RSD分别为1.44%，3.16%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品粉末（批号为210112）2 g，各6份，分别加入一定质量浓度的单一对照品溶液，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表3。

表3 香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷的加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of typhaneoside and isorhamnetin-3-O-neohesperidin（n=6）

2.3.4 样品含量测定

取样品适量，分别按2.3.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果见表2。

3 讨论

垂盆草TLC鉴别法建立初期将槲皮素、山柰素、异鼠李素作为鉴别指标，但试验结果显示相似条带较多，且多为假阳性，故最终选用垂盆草对照药材进行鉴别，其特征条带明显且无干扰、方法稳定。蒲黄TLC鉴别方法条件严苛，需多次进行纯化处理。且由于药材中黄酮类物质较多，条带模糊难辨，尝试多种展开体系后仍效果欠佳，故对显色剂进行筛选，最终采用10%硫酸乙醇溶液显色，色谱图清晰美观。豨莶草TLC鉴别方法对样品提取溶剂进行了考察，最终选用70%甲醇为提取溶剂，甲醇复溶处理过程样品中析出大量多糖，避免了展开时的多糖拖尾现象。除上述3味草本药材外，煅牡蛎、海藻两味药材主要成分为碳酸钙和多糖［8-9］，鉴于药材特殊性，未建立相关TLC研究内容。

以软坚清脉颗粒方为基础，前期曾选取豨莶草中奇壬醇进行含量测定，但其中奇壬醇含量极低，难以满足质控要求，故舍弃；煅牡蛎作为矿物类药材，其中的钙离子含量可作为质量控制因素［10］，但由于颗粒颜色较深导致显色反应中颜色变化不明显，难以确定是否存在阴性干扰，故舍弃；海藻主要成分为多糖，现有检测方法暂无法对其进行准确定量分析。因此，本研究中选用了垂盆草及蒲黄药材中指标成分进行定量分析，且研究发现槲皮素、山柰素、异鼠李素均可通过不同路径降低动脉硬化程度［11-19］，香蒲新苷和异鼠李素-3-O-新橙皮苷等黄酮苷类成分有抑制凝血、活血化瘀功效［6］。故本研究中以垂盆草、蒲黄的指标成分作为定量分析成分具有一定的合理性。

与已有研究［20］相比，本研究中确定蒲黄提取时间为45 min，提取方式为超声提取；垂盆草回流水解时间为45 min，盐酸体积分数为20%。本研究中皆选取了提取时间较短，操作简便的提取方式，不仅最大限度地保留了有效成分，还提高了工作效率；将蒲黄、垂盆草的指标成分含量分开测定，分析时间较短，分离度良好，专属性强，符合产业化生产对中药制剂质量分析快速准确的需求。