概率在分子遗传学教学中的应用

2023-01-02张潇潇王宇传刘秋云

科教导刊·电子版 2022年29期

张潇潇，甘滔，王宇传，刘秋云

（1.中山大学生命科学学院，广东广州 510275；2.昆明医科大学生物医学工程研究院/云南省干细胞和再生医学重点实验室，云南昆明 650500；3.赣南医学院基础医学院，江西赣州 341000；4.华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病基础医学重点实验室，河北唐山 063210）

分子遗传学是在遗传学基础上发展起来的一门学科，主要研究基因的结构与功能、基因表达的调控、表观基因组学调控等等。在以前发表的文章里，我们阐述了分子遗传学的教学大纲，以及二项式分布与珀松分布在分子遗传学课程里的具体运用[1]。然而，另有一些该课程的内容涉及概率的运用。这些计算方法的学习有利于学生更好地掌握课程的精髓，同时也有助于他们将来的学习和工作。

1 组织学生学习概率的实例

1.1 实例一：概率在RFLP分子标记上的应用

最早的分子标记是ABO血型。在18、19世纪，欧洲人认为输血可以预防疾病、有益于健康。但他们观察到输血后部分人死亡，由此促使了ABO血型和更多其他血型的发现。真正的第一代分子标记是RFLP，由美籍华人简悦威和一位西方科学家同时发现。他们通过限制性内切酶酶切DNA、电泳、Southern杂交，发现镰刀细胞贫血病的致病基因产生了两个条带，而野生型只有一个条带。部分限制性内切酶的识别序列为回文对称。RFLP的建立由普林斯顿大学的David Botstein教授在20世纪70年代完成。

我们可以从概率的视角研究DNA，比如碱基配对概率是1/4，而错配概率是3/4。如可选嘌呤碱基概率是2/4，可选嘧啶碱基也是2/4。对于EcoR I限制酶来说，其识别序列与切割序列均为GAATTC，所以概率是(1/4)6[2]。

1.2 实例二：概率在AFLP分子标记上的应用

AFLP是Amplified Fragment Length Polymorphism的简称，在植物研究上使用的较为广泛[3]。一般情况下采用一个6碱基酶和一个4碱基酶共同切割，加上接头，再进行PCR扩增。由于4碱基酶酶切位点极多，特异性主要由6碱基酶的特异性所决定。综上所述，平均4096个碱基有一个6碱基酶酶切位点，这导致基因组AFLP扩增产生极多的片段。为了减少片段数量，需要在两个引物的3’端分别加上2个和3个碱基，这样理论上减少扩增片断数量至原来可能数量的(1/4)2X(1/4)3。

1.3 实例三：概率在SNP分子标记上的应用

SNP是单核苷酸多态性[4]，在基因组上一般是双等位的，作为分子标记区分度还不够。为了更高精度的研究遗传连锁，我们可以考虑使用多对SNP，比如A/a,B/b,C/c三对SNP。这样共有2X2X2=8种组合方式。将家系的基因型分成了8组。与遗传疾病的连锁关系的分析从而更为精确，特别是在关联分析上很有价值。

1.4 实例四：概率在遗传密码扩增上的应用

科学家提出了引入更多的碱基对来扩增遗传密码数量[5]，一组科学家通过疏水配对引入了一对碱基，将遗传字母增加到6个。那么这样的DNA的4碱基、6碱基、8碱基回文对称的限制性内切酶的识别频率怎么计算呢？那就是(1/6)4、(1/6)6、(1/6)8。

另一组科学家将遗传密码的碱基用氢键配对扩增到8个，这样的DNA的4碱基、6碱基、8碱基限制性内切酶的识别频率就是(1/8)4、(1/8)6、(1/8)8。如此类推，遗传密码的增加将使蛋白质的多样性得到极大的扩展。

1.5 实例五：概率在差异显示上的应用

差异显示（Differential Display）可以展示一对DNA样品的mRNA条带的差异。比如抗旱诱导的样品与非抗旱诱导的样品的比较，癌症组织与癌症组织旁边正常组织的比较。这个技术用随机引物与Oligo-dT引物配对进行PCR扩增，而Oligo-dT引物不能锚定于cDNA，故不能形成固定大小的片段。为了锚定引物，可在Oligo-dT引物的3’端加入2个碱基(A/G/C)(A/G/C/T)。这样Oligo-dT锚定引物就共有3X4=12组。但是，另一端的随机引物数为20组左右，通过配对产生了20X12=240个PCR组合，工作量太大。为了减少工作量，在Oligo-dT引物的3’端加入1个碱基(A/G/C)。这样Oligo-dT锚定引物就共有3组。PCR组合减少为20X3=60个，工作量大大减少。

1.6 实例六：概率在古尸上的病毒基因组的恢复研究上的应用

坟墓里的古尸有些携带了古代流行病病毒等致病源。出于研究的需要，有时要恢复这些病毒基因组的完整序列。而尸体上的病毒DNA或RNA长度一般只有几十个碱基。长的引物和较高的退火温度无法PCR扩增或逆转录/PCR扩增，那么需要使用6碱基寡聚核酸（oligo）N6，其配对概率为（1/4）6。N6具有所有的6碱基组合，使用这个技术科研人员恢复了1918年西班牙流感H1N1的基因组。

1.7 实例七：概率在简并DNA与定向进化研究上的应用

有时候需要对一个氨基酸位点进行所有氨基酸的替换，可以设计中间含NNN的引物，进行同源重组和双交换。为了减少终止密码子，可使用含NNK的Oligo，K代表T/G，这样只有4X4X2=32个密码子，终止密码子只有一个，其他氨基酸的密码子数量也得到了均一化。如果要对两个氨基酸同时替换，可使用中间含NNKNNK的Oligo。

1.8 实例八：概率在分子标记辅助育种研究上的应用

在利用分子标记进行作物辅助育种研究时，一般使用单分子标记。方差是研究遗传性状的重要方法。有时，尽管两组样品平均值类似，但变异的幅度不一样，产生的方差大小不一样。单分子标记与产量性状等存在一定重组，因此分析具有误差。基于这一考量，MIT的EricLander提出用区间作图法进行植物基因定位和克隆。原理是用两个分子标记来定位某个决定性状的基因。假设有两对等位基因A/a和B/b，如果A和B之间存在一个高产基因Y,a和b之间存在一个低产基因y，A和B的重组距离为0.2,那么a和b之间存在Y的概率为x(0.2-x)，即通过一个双交换a和b之间也可以得到一个高产等位基因Y。A和B之间存在一个高产基因Y的概率变为0.2-x(0.2-x)。通过类似这样的加权处理，并结合线性回归和最大似然法，Eric Lander开发出了广泛使用的植物遗传研究技术，加速了植物育种革命。