粮食真菌群落组成及多样性研究进展

祁智慧， 张海洋， 田 琳， 唐 芳

(国家粮食和物资储备局科学研究院1，北京 100037) (粮食储运国家工程实验室2，北京 102209)

自然界中真菌无处不在。真菌群落组成是指在一定时间和空间内分布的真菌物种种群集合及种类组成。真菌多样性是指在一定时间和一定区域内所有真菌物种及其遗传变异和生态系统的复杂性总称，包括物种多样性、遗传多样性、和生态系统多样性[1，2]。研究粮食真菌群落组成及多样性，就是研究粮食在一定的时间或空间内，寄附或生长在其表面或内部的真菌种类组成，活动状态及遗传变异等情况。这与粮食行业中早期提到的粮食真菌区系调研所要完成的工作有相似之处，但研究结果更加深入。粮食作为食物到达消费者餐桌，要经历田间生长、收获、运输、储藏、加工等多个环节。若处理不当，任何一个环节都会为真菌生长繁殖创造有利条件，从而在粮食表面或内部形成真菌群落[3]。例如，粮食作物在田间生长时，当气候条件适宜，空气和土壤中的微生物便会不同程度地侵染粮食作物，引发病害导致减产，有些甚至产生真菌毒素[4]。粮食收获后会携带大量田间真菌进入储藏环节，初步形成粮食真菌群落。在储藏期间，粮堆作为一个复杂的生态系统，粮仓微环境的变化可为储藏真菌的萌发生长提供条件，从而改变粮食的真菌群落组成。部分储藏真菌物种的大量繁殖会导致粮堆发热霉变，真菌毒素积累，严重影响储粮安全[5，6]。由此可见，无论自然传播或人为操作，真菌对粮食的污染难于避免[7]。

粮食上真菌的种类、活动状态与粮食质量和卫生安全密切相关[3]。有些真菌物种能引起粮食品质劣变[8，9]，而有些能产生真菌毒素严重影响食品卫生安全[10]。据报道，在欧洲和一些发展中国家，每年由于真菌污染导致的粮食生产损失超过10%[11]。因此，深入研究粮食真菌群落组成以及变化规律，是保障粮食品质优良和食品卫生安全的基础前提。我国自20世纪50年代开始重视粮食微生物的研究，历时半个多世纪，从最初的翻译国外文献到系统研究国内粮食微生物区系，从传统的微生物培养鉴定方法到分子系统学及生物信息技术的应用，我国粮食微生物研究逐渐深入，且更加系统规范。本文对我国粮食真菌群落组成及多样性研究进展进行综述，初步探讨了真菌群落组成及多样性与真菌毒素污染的关系，为后续粮食微生物的深入研究提供参考。

1 粮食真菌分类

粮食微生物研究中常用“霉菌”代表粮食上常见的真菌类群[12]，霉菌是丝状真菌的通称，不是分类学上的名词，在分类上属于真菌界的各个门。粮食真菌包括酵母和丝状真菌，其中酵母所需水分活度较高，在粮食中分布较少，而丝状真菌在粮食中分布广泛，研究较多，这也是部分研究者用“霉菌”一词的主要原因，而本文使用现代分类系统中“真菌”进行后续综述。

研究粮食真菌群落组成，首先要明确真菌分类。真菌的分类系统十分复杂，且不断发展演替。早期粮食真菌的分类系统以真菌研究学术界采用最为广泛的Ainsworth分类系统为主[13]。随着分子系统学的建立与发展，真菌分类更为客观高效，现代真菌分类系统也随之建立[14, 15]，一些粮食真菌的分类地位也随着真菌分类学的发展而发生改变，因此，近些年粮食真菌物种分类地位和名称变化较大，需对其进行系统研究，且进一步规范化。

为了便于描述粮食从田间收获到储藏期间真菌群落组成的变化，研究者对粮食真菌进行了划分。早期Christensen[16]根据粮食真菌的侵染环节及对水分含量的需求，将其分为田间真菌和储藏真菌。后期陆续有研究人员在此基础上结合粮食收获前、收获期和收获后环节及真菌生长适宜水分活度(Aw)范围，将粮食真菌分为3种主要类型：田间真菌指亲水型的植物病原真菌，主要在粮食作物田间生长或收获期侵染粮食籽粒，如附球菌属Epicoccum、镰孢菌属Fusarium和链格孢属Alternaria等；过渡真菌：对水分活度要求相对宽泛，以腐生和嗜热真菌为主，主要在收获前后污染谷穗或受伤的植株，如毛霉属Mucor、枝孢属Cladosporium和根霉属Rhizopus等；储藏真菌为嗜旱真菌，对水分活度要求相对低，主要在粮食储藏期间侵染粮粒，如曲霉属Aspergillus和青霉属Penicillium等[17]。将粮食真菌分为3种类型，充分体现了环境因素对粮食上优势菌的决定性作用，是粮食真菌群落组成及演替规律的研究基础，对后续研究起到很好的指导作用。

2 真菌对粮食造成的危害

长期以来国内外研究者非常关注真菌对于粮食造成的危害。粮食上真菌污染产生的危害主要体现在两个方面，一是对粮食质量的影响，二是产生真菌毒素威胁食品卫生安全。真菌污染对粮食质量的影响主要包括：种子退化、变色、干物质损失、气味异常、霉变发热等。具体表现为真菌侵染粮粒能使粮食种子丧失活力，发芽率降低。种子胚部营养丰富且种皮最为薄弱，易受真菌侵染，Prom[18]发现弯孢属Curvularia和镰孢菌属Fusarium物种侵染与种子发芽率下降之间存在高度相关性，Moshiur 等[19]也发现玉米种子的发芽率下降与籽粒上的真菌之间存在密切联系；真菌感染谷粒的颖片或内核是引起粮食变色的主要原因，稻平脐蠕孢Bipolarisoryzae、禾谷镰孢Fusariumgraminearum、稻梨孢菌Pyriculariaoryzae、稻黑孢霉Nigrosporaoryzae和黑色附球菌Epicoccumnigrum等均能引起粮食变色[20, 21]；引起粮食干物质损失，真菌生长要消耗粮食籽粒上营养成分，进而导致质量损失[22]，扫描电子显微镜显示真菌菌丝能渗透到小麦胚乳中，代谢产生蛋白酶和淀粉酶，降解营养成分(淀粉和蛋白)为己所用，从而加速干物质损失[23]；产生霉变气味，真菌在富含营养物质的基质(例如谷物)上生长时会产生挥发性化合物，20世纪70年代，研究人员证明腐生真菌会产生挥发性物质，引起粮食霉变异味[24]；引起粮堆霉变发热[25]，真菌生长会呼吸产生热量，热量在粮堆中聚集后，会引起粮堆温度升高。高温会使粮食脂肪酸值等指标发生变化，加速品质劣变[26]，Sinha等[27]研究表明，环境温度为-5 ℃时，真菌快速生长繁殖释放的热量可能导致谷物温度升高至64 ℃。

粮食部分产毒真菌生长能产生具有强烈毒性和致癌性的真菌毒素，可通过食入、吸入或皮肤接触进人体内，威胁人类的身体健康，造成严重的食品卫生安全问题[28]。联合国粮农组织估计，全世界谷物供应的25%受真菌毒素污染[29]。粮食中常见的真菌毒素主要是由曲霉属Aspergillus、镰孢菌属Fusarium和青霉属Penicillium物种产生的黄曲霉毒素(Aflatoxins, Afs)、伏马毒素(Fumonisins, FBs)、呕吐毒素(Deoxynivalenol, DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenon, ZEA)等[30, 31]。其中一些真菌毒素的毒性较强，具有致命性且化学性质稳定，给人类造成的损失和危害难以估量[32]。为确保食品卫生安全，欧盟委员会对真菌毒素水平进行了严格的限制。研究不同阶段粮食真菌群落组成及多样性，了解真菌污染情况，提出真菌及真菌毒素污染精准防控策略，对于保障粮食品质优良，确保食品卫生安全具有十分重要的意义。

3 粮食真菌群落组成及多样性研究发展历程

我国早在20世纪50年代开始重视粮食微生物的研究，已历时半个多世纪。最初粮食微生物研究以梳理和翻译国外研究结果为主，80年代首次针对我国粮食真菌区系进行了全面系统的调研。随着研究技术和手段的不断更新，从传统的培养及表观形态学鉴定，到分子测序分析及生物信息技术的应用，研究结果从简单的真菌区系调研、分类、鉴定，发展到真菌群落组成与环境因子、真菌毒素等相互关系的复杂研究。随着研究不断深入，对于真菌及真菌毒素的精准防控更加具有指导意义。

3.1 基于传统形态学鉴定的研究

我国科学家20世纪80年代初首次全面开展粮食微生物的研究，对主要粮食作物小麦、稻谷、玉米等微生物区系进行系统的调研[33]。此次调研参考了国外对于粮食真菌的分类，以真菌区系调研为主，分离的菌株约50属，182种[33]。稻谷中分离的真菌约30属，84种，优势菌26种[34]。小麦中分离鉴定的真菌为30属，101种[35]。玉米中分离鉴定的真菌为15属，60种[36](“种”指菌株种类的数量，很多菌株未鉴定到物种水平)。调研结果显示粮食上常见的田间真菌主要包括枝孢属Cladosporium、链格孢属Alternaria、镰孢菌属Fusarium和附球菌属Epicoccum等，储藏真菌主要包括曲霉属Aspergillus、青霉属Penicillium、根霉属Rhizopus和毛霉属Mucor等[33]。全国范围内的调研结束后，陆续有科研人员选取我国特定的省份，针对单一粮仓研究粮食真菌区系[37, 38]，分析不同储藏条件下真菌群落组成的变化，结果发现在黄熟期和新收入库的粮食上以田间真菌为优势菌，腐生的储藏真菌极少，储藏2年后，田间真菌减少直至消失，储藏真菌逐渐增加，而后又减少[34, 39]。

这一时期的真菌区系调研，主要采用纯培养获得菌株，基于传统形态特征比对进行菌种鉴定，受当时菌种鉴定资料及鉴定技术限制，只有部分分离株鉴定到种，大部分的分离株只能鉴定到属，田间真菌和储藏真菌群落组成的研究结果最终以种、属混合列出。而且，真菌群落组成与环境因子关联密切，时隔30多年，我国粮食种植环境、耕种习惯、收储条件以及气候因素等均发生了较大变化。因此，有必要重新对全国粮食真菌的群落组成及多样性进行详细研究。

3.2 基于形态学和分子生物学鉴定的研究

随着分子生物学的发展，真菌物种的基因数据库不断扩充完善，利用核酸序列构建系统发育树使真菌的分类和鉴定更加客观高效。近些年，粮食行业研究人员逐渐将真菌的分子系统分析方法引入到粮食真菌研究中。都立辉等[40]研究了淮稻5号的真菌群落组成，对稻谷原粮上分离培养得到的菌株，在传统形态学鉴定的基础上，选择内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS区)及 28S rDNA 两种基因片段比对，将大部分菌株鉴定到种水平并构建了系统发育树，明确了物种之间的亲缘关系。葛志文等[12]以湖南和湖北仓储稻谷为研究对象，对稻谷储藏期间主要优势菌进行了分离纯化，通过观察其形态特征，结合ITS区分子测序结果，明确湖南和湖北仓储稻谷的主要优势菌为黄曲霉Aspergillusflavus、黑曲霉A.niger、亮白曲霉Aspergilluscandidus和灰绿曲霉Aspergillusglaucus等。祁智慧等[41]基于形态学和分子生物学鉴定首次对我国13个稻谷主产省收储环节的稻谷系统的开展真菌组成和多样性的调研，共分离到600多株菌，这些菌株分属于17属，73个物种。研究发现北方地区收获期稻谷主要优势菌为芽孢状枝孢Cladosporiumcladosporioides和Cladosporiumanthropophilum(暂无明确中文名称)，南方收获期稻谷主要优势种为黄曲霉A.flavus和黑曲霉A.niger。进入储藏期后，储藏微环境相对稳定，耐旱真菌阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami和多育曲霉Aspergillusproliferans成为优势菌。南方收获期感染的黄曲霉A.flavus和黑曲霉A.niger(主要产毒真菌)进入储藏期后仍保持优势比例，导致储藏期间潜在的毒素污染风险增加。针对收获和储藏环节真菌群落组成的研究及优势菌分析，能够准确了解粮食真菌污染情况，有利于对粮食真菌及真菌毒素污染危害进行风险评估。

3.3 基于高通测序技术的研究

3.1和3.2提到的研究，均是基于纯培养方法获得样品中可培养真菌的群落组成，然而，自然界中还有大部分真菌是不可培养的或在某种培养条件很难生长。随着分子生物学的不断发展，高通量测序技术(High-throughput Sequencing, HTS)有效解决了大量不可培养真菌物种的难题。通过对样品中全部微生物基因组测序，结合环境因子等多种影响因素，采用生物信息分析方法，可对粮食微生物的群落组成及多样性进行深入研究。近几年，基于HTS研究粮食真菌组成及多样性已经得到应用。

徐圆程等[42]基于HTS研究储藏稻谷中的真菌群落结构与优势菌，结果显示稻谷中的优势种不仅包含黄曲霉A.flavus等常见的菌种，同时还包括粮食中鲜有报道的物种，如球孢白僵菌Beauveriabassiana和小孢暗球腔菌Phaeosphaeriamicroscopica等。Chai等[43]通过高通量16S rRNA和ITS区扩增子测序分析储藏条件对稻谷微生物群落结构的影响，进一步证实储藏温度和水分对稻谷中微生物群落的活动影响明显，严控储藏条件是防止稻谷储藏过程中霉变的有效措施。岳晓禹等[44]应用HTS研究小麦在储藏过程中真菌群落的变化，明确储藏时间和粮堆深度是影响小麦真菌生长和演替的主要因素。Solanki等[45]采用HTS研究了磷化氢熏蒸对于小麦真菌菌群组成和多样性的影响，全面阐述了熏蒸在抑制霉菌生长方面的作用和局限性。本课题组通过HTS对全国13个主产区稻谷的真菌群落组成与环境因子之间的关系进行系统分析，发现冬季平均温度、年平均降雨量和收获季节的风速是影响真菌群落组成的主要因素。

利用高通量测序技术从基因组水平上研究真菌组成及多样性，打破了传统培养鉴定的限制，获取信息量大，通过生物信息学分析，可以深入研究粮食真菌群落组成差异及环境因素之间的关系，为产毒真菌及真菌毒素污染精准防控提供了新的思路。

4 粮食真菌群落组成与真菌毒素污染的关系

真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，是真菌在竞争空间资源和营养物质时，作为抗菌素抑制其他物种生长的手段[46]。粮食上不同的真菌群落组成，产生真菌毒素种类和数量存在差异[47]，而真菌群落组成受气候条件、土壤、地理位置等多种因素影响[48，49]。MüllerF.graminearum[50]研究表明，禾谷镰孢与细极链格孢Alternariatenuissima共同生长时，细极链格孢A.tenuissima产毒能力显著降低；黄色镰孢Fusariumculmorum与细极链格孢A.tenuissima共同生长，黄色镰孢F.culmorum产DON和ZEN的能力明显提高。Giorni等[51]研究黄曲霉A.flavus、禾谷镰刀菌F.graminearum、串珠镰刀菌F.verticillioide3种产毒真菌共同生长对单个真菌产毒能力的影响，发现两种镰孢菌产毒能力会受黄曲霉A.flavus影响大幅降低，而黄曲霉A.flavus产毒能力不受影响。Neme[52]在研究粮食储藏期间环境因子对真菌生长及产毒情况影响时，提出了自然界中真菌以共生与竞争两种模式共存，共生过程中通过改变代谢途径产生真菌毒素以提高竞争力，不同的真菌组成会影响产毒情况。粮食在田间、收获及储藏期多个环节都可能感染真菌。气候及农耕习惯(土壤)等条件差异会引起的粮食真菌组成的差异，进而影响到产生真菌毒素的种类及积累量[53，54]。Edwards[49]的研究也表明，粮食上真菌毒素污染情况不仅受气候条件(环境温湿度)的影响，还受土壤环境中真菌种类、数量及分布的影响，主要因为土壤真菌组成会影响粮食真菌组成。

由此可见，真菌毒素的污染程度与真菌物种组成及环境因子之间存在复杂的关系。真菌毒素污染的预测，除了考虑环境气候条件、成熟期温湿度及产毒真菌的产毒能力外，还应该考虑真菌群落组成，真菌共生与竞争的生物驱动因素，这样可以进一步提高毒素污染预测的准确率。

5 粮食真菌群落组成及多样性的研究应用

真菌物种之间以共生与竞争两种模式共存，有些真菌物种之间通过竞争可抑制产毒真菌生长，降低真菌毒素含量，在毒素的生物防控方面发挥重要作用[55, 56]。在真菌毒素生防菌研究中，木霉属Trichoderma真菌具有很大的拮抗潜力，可抑制产毒真菌的生长，降解真菌毒素，其中绿色木霉Trichodermavirens抑制黄曲霉A.flavus生长降低黄曲霉毒素(AFs)含量效果良好[56]，棘孢木霉T.asperellum能抑制串珠镰刀菌F.verticillioide的生长。木霉属Trichoderma一些物种不但能抑制的禾谷镰刀菌F.graminearum生长，还能降解玉米赤霉烯酮(ZEN)[57, 58]。让不产毒素的黄曲霉A.flavus分离株与产毒素的分离株竞争抑制，是目前用于减少玉米和花生中AFs污染广泛使用的生物防治方法，防治效果明显[59]。

生物防控技术是化学药品有效替代品之一，在控制田间有害真菌发生，减少谷物真菌毒素污染中发挥着重大作用。在研究粮食真菌群落组成及多样性时，从全国粮食主产区收集粮食样品，采用传统的分离培养法获得大量真菌菌种资源，结合形态学和分子生物学进行真菌物种鉴定，构建菌种资源库。同时运用高通量测序技术获得粮食上覆盖全部真菌群落的基因信息，进行生物信息分析，研究不同地区、不同环节粮食上真菌物种的共存模式及物种之间的竞争拮抗关系，为真菌毒素的生物防控菌种的筛选提供一个新的途径。

6 结语

我国粮食真菌研究始于20世纪50年代中期，60年代初通过翻译国外研究资料，编著了粮食微生物学的专著教本，20世纪80年代初对全国范围内主要粮种的真菌区系(群落组成及多样性)进行了系统的调研和汇总整理，为我国粮食微生物研究奠定了基础。但早期受研究方法及技术的限制，真菌组成以种、属并列形式给出，结果不够精准和深入。进入21世纪后，随着分子技术的快速发展和应用，研究技术手段逐步增加，可以从基因层面全面系统的研究粮食真菌组成，研究结果更准确。随着生物信息分析学的发展，使得粮食真菌群落组成差异及其影响因素的深入研究成为可能，使我国粮食真菌群落组成及多样性的研究迈入新阶段，为粮食真菌毒素污染精准防控及生防菌株筛选开拓了新路径。