液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱同时测定粮油中77种真菌毒素

袁光蔚， 莫紫梅， 周嵩煜， 戴向东， 叶 金，吴 宇， 伍先绍， 胡 蓉， 王海波

(广西-东盟食品检验检测中心1, 南宁 530029) (国家粮食和物资储备局科学研究院2,北京 100037) (广西壮族自治区粮油质量检验中心3,南宁 530031)

真菌毒素为真菌生长繁殖过程中产生的毒性次级代谢产物[1]。目前，已确认化学结构的真菌毒素有400多种[2]。研究表明，部分真菌毒素具有致畸、致癌、致突变、肝肾毒性、免疫毒性和神经毒性等危害[3]。近年来，受全球气候变暖等因素的影响，世界各国的真菌毒素侵染事件屡见报端，特别是农产品中多种真菌毒素协同污染现象频频发生，多种真菌毒素的检测越来越受重视[4，5]。广西为高温高湿环境，非常适宜黄曲霉毒素等真菌毒素的繁殖，因此，对广西地区主产粮油及其制品进行真菌毒素污染风险的监测、评估及治理迫在眉睫。

真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫法、胶体金快速检测法、薄层层析法、荧光光度法、液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法等。其中酶联免疫法、胶体金快速检测技术属于快速检测方法，具有简单、快速、便捷的优势，但也存在着假阳性、假阴性的风险[6]；薄层层析法操作过程复杂，重复性较差，在检测上的使用受到限制，一般只做定性或者粗略的定量实验[7]；而荧光光度法、液相色谱法虽为当前的主流检测方法，但其前处理较为复杂，对检验人员的操作技术要求较高，且免疫亲和柱成本高，对多种毒素同时检测的能力有限[8]；高效液相色谱-质谱联用法兼具通用性和选择性，灵敏度高，适合多组分毒素的同时检测，但由于其为低分辨率质谱，不能提供精准的结构碎片信息，在分析复杂基质样品时常常存在假阳性等问题，具有一定的局限性。

四极杆-静电场轨道阱质谱将四极杆的高离子选择性和静电场轨道阱高分辨扫描技术有机结合，分辨率、灵敏度、抗干扰能力更强，卓越的定性能力基本避免了假阳性情况的发生，在真菌毒素分析领域中得到快速发展和应用：如Alfonso等[9，10]结合QuEChERS技术，检测了梨汁中14种镰刀菌属真菌毒素及植物药中16中霉菌毒素；胡巧茹等[11]通过含2%甲酸的乙腈萃取，Captive EMR-Lipid柱纯化，对谷物产品中20种霉菌毒素进行了筛选和确认；Ellen等[12]开发了昆虫中23种真菌毒素的检测方法；Yelko等[13]建立用于同时测定大豆汉堡中21种霉菌毒素和12种异黄酮的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS方法等。但面对日益增长的真菌毒素监测数量及日常监管任务重、急、快的需求，仍然面临着毒素检测种类少，前处理耗时长等压力。

本研究采用混合溶剂对样品进行直接提取，然后稀释、过滤，最后通过高分辨率质谱进行快速筛查、定量，以期满足粮油产品中真菌毒素的日常监管防控工作需要。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；乙酸铵(色谱纯)；77种真菌毒素混合标准储备溶液(质量浓度为40～8 000 ng/mL)；15种真菌毒素同位素内标混合溶液(质量浓度为1～265 ng/mL)；植物油样品(广西各地市植物油抽检样品)。

Milli-Q 超纯水系统，KS260振荡仪，ROTANTA460/460R离心机，A-14C离心机，超高效液相-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱配H-ESIⅡ源、Ultimate 3000 液相色谱系统及TraceFinder4.1数据处理系统。

1.2 方法

1.2.1 样品的前处理

固体样品经粉碎，过40目筛后，混匀备用；液体样品直接取样使用。取5 g混匀的样品，置于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合提取溶液，振荡提取15 min，4 600 r/min离心10 min，精密转移0.70 mL上清液于2 mL离心管中，然后加入0.70 mL水稀释，涡旋混匀1 min，在4 ℃、10 000 r/min下离心10 min，上清液经0.22 μm的PTFE滤膜过滤，取180 μL滤液和20 μL同位素内标混合储备液于具有内插管的进样小瓶内，混匀待测。

1.2.2 标准溶液的配制

按样品的前处理方法处理3种不同基质的空白样品，得空白基质滤液；取混合标准储备液，用空白基质滤液将其逐级稀释，配置成浓度比例为1∶2∶4∶10∶20的系列混合标准工作液，然后分别取180 μL系列混合标准工作液和20 μL同位素内标混合储备液置于具有内插管的进样小瓶内，混匀，即得系列浓度混合标准曲线溶液，浓度范围见表1。

1.2.3 色谱条件

1.2.3.1 液相色谱条件

Waters CORTECSTM ® UPLC ® C18柱(1.6 μm，100 mm × 2.1 mm)；流动相A为含0.1%(体积分数)的甲酸和1 mmol/L乙酸铵的水溶液，B为甲醇。梯度洗脱条件：0～2 min，90% A；2～3 min，90% A～80% A；3～4 min，80% A～79% A；4～5 min，79% A～74% A；5～7 min，74% A；7～10.5 min，74% A～40% A；10.5～13.5 min，40% A；13.5～14.5 min，40% A～5% A；14.5～17 min，5% A；17～18 min，5% A～90% A；18～21 min，90% A；流速：0.3 mL/min，柱温40 ℃；进样量2 μL。

1.2.3.2 质谱条件

扫描模式：正离子；喷雾电压：3.20 kV；鞘气流速：35 L/min；辅助气流速：10 L/min，温度：300 ℃；离子传输管温度：320 ℃；采集模式：Full MS/dd MS2；一级质谱分辨率：70 000；扫描范围：70～900m/z；二级质谱分辨率：17 500；触发阈值：2.0e4；归一化碰撞能：20、40、60。

1.3 数据处理

运用仪器自带的TraceFinder 4.1数据处理系统及Mass Frontier 7.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

当前，食品中真菌毒素的提取一般选择甲醇、乙腈等与水的混合溶液作为提取溶剂。乙腈溶解性能优良，对极性和非极性的真菌毒素均有较高的提取率，并能促使样品中蛋白质变性沉淀，进一步提高提取效率[14]。部分真菌毒素对pH比较敏感，在提取溶剂中加入辅助试剂可提高联合提取效果[11,14]。研究发现[15，16]，甲酸、乙酸等可提高诸如伏马毒素B1、伏马毒素B2、赭曲霉素A、桔霉素、夫马洁林等的提取回收率，如夫马洁林为酸性化合物，当pH降低到一定程度，使其处于非解离状态时，在玉米样品中的回收率可高达80%。经过实验优化，选择了以乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)为提取溶剂。

提取溶液一般选择QuEChERS技术或多功能柱进行净化。尽管净化步骤确实纯化了上机溶液，减少了杂质的影响，但也增加了实验步骤，降低了整体效率。胡巧茹等[11]实验表明，QuEChERS技术使用的乙二胺-N-丙基硅烷、石墨化炭黑等净化剂，会吸附部分真菌毒素，导致回收率不够理想；郑翠梅等[17]在实验中发现，使用Mycosep226净化柱时，对伏马毒素B1、伏马毒素B2、赭曲霉素A有较严重的吸附作用。本研究中，检测的真菌毒素多达77种，它们结构各异，理化性质也不尽相同，为兼顾化合物的整体回收率，本实验结合仪器本身抗污染、抗干扰能力强的特点，最终采取了直接提取，然后用纯水进行稀释的前处理方法。既简化了实验步骤，提高了检验效率，获得了较满意的回收率，又降低了溶剂效应的影响，利于获得峰形良好的色谱峰。

2.2 液相条件的优化

77种真菌毒素，极性各异，本实验采用了Waters CORTECS ® UPLC ® UPLC C18(1.6 μm，2.1 mm×100 mm)色谱柱，其通用性较强，极小的粒径使色谱柱具有极高的柱效，对多种化合物的分离具有较大的优势，较小的内径和适中的长度既保证了柱容量，又兼顾了流动相的消耗。

常用的流动相中，甲醇的极性较乙腈强，洗脱能力相对较弱，可兼顾多化合物检测的整体分离效果。

图1 流动相中加甲酸前、后桔霉素的提取离子流图

实验发现，在标准溶液浓度相同的情况下，在流动相水相中加入了有机酸时，部分化合物的响应明显增强了，应该是有机酸的存在促进了化合物的离子化效率，使响应增大，通过优化有机酸的种类和浓度，选择了在水相中加入0.1%(体积分数)甲酸。图1为桔霉素在流动相中加入甲酸前、后的响应对比。同时发现，在流动相中加入一定浓度的乙酸铵时，可以提高部分化合物的响应和改善色谱峰形，应该是乙酸铵的加入为化合物的加合提供了NH4+的来源，也影响了其色谱行为，如图2所示，水相中未加乙酸铵时，双氢麦角汀的保留时间延后，且峰形明显的分叉。

图2 流动相中加乙酸铵前、后双氢麦角汀的提取离子流图

本次实验选择了含0.1%(体积分数)的甲酸、1 mmol/L乙酸铵的水溶液和甲醇溶液为流动相进行梯度洗脱，并考虑到降低溶剂效应及防止水相中的乙酸铵在高比例有机相中析出导致色谱柱堵，流动相初始梯度使用了较高比例的水相。

2.3 质谱条件的确定

通过对混合标准溶液进行全扫描模式采集，确定了各个化合物的最佳电离模式以及加合形式，详见表1。优化过程中发现，除脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物等为数不多的几个化合物最佳电离模式为负离子模式外，其余皆为正离子模式，由于仪器的采集速度有限，为保证定量所需采集点数，本实验中所有化合物皆采用正离子模式，以避免采集过程中正负模式切换导致采集点数不足的问题。采用Full MS/dd MS2采集模式对混合标准溶液进行数据采集，获得了化合物的保留时间、母离子质荷比及二级质谱图。利用Mass Frontier 7.0软件推测各化合物可能的质谱转换裂解途径，结合实际采集的二级质谱图，确认了其二级特征碎片离子，详见表1。图3为以黄曲霉毒素B1为例的质谱转换裂解途径。以分子式、子离子、保留时间等信息为基础，建立了数据库。由于本实验检测的化合物组分较多，通过数据库的匹配筛查，再根据最终筛查结果有目的的进行定量，可有效降低工作量，提高数据处理效率。

图3 黄曲霉毒素B1质谱转换裂解途径

表1 77种目标化合物的分子式、储备液浓度和质谱参数

续表1

续表1

2.4 基质效应

ESI源中基质效应的产生是由于受共流出物质的干扰，产生竞争性电离，导致目标物响应增强或者降低的现象[18]。由于本实验提取方法不经过净化，样品中会存在着一定的基质干扰，因此，本实验分别对大米、小麦、植物油三类样品的基质效应进行了考察，以目标物在空白基质液中的峰面积与在纯溶剂中峰面积的百分比来评估基质效应，高于100%说明有基质增强效应，低于100%则说明有基质抑制效应。结果显示，77种真菌毒素的基质效应为70.0%～206.0%，其中，90%～110%占71.86%，<80%及>120%的为总数的8.23%，说明化合物在这三种基质中存在一定的基质增强或抑制效应。如细交链孢菌酮酸在植物油基质中基质增强作用严重，达206.0%，而T-2四醇在大米基质中则存在较明显的基质抑制效应，为70.0%，这可能是由于样品提取液中的油脂以及磷脂类物质等影响了某些化合物的离子化效率导致的结果。

稳定同位素稀释法和基质加标曲线法是常见的降低基质效应的方法，其中稳定同位素稀释法是最有效的方法之一，但由于稳定同位素内标的价格较为昂贵，且难以获得，故本实验仅对国家日常监督中常见的15种真菌毒素采用了稳定同位素稀释法定量，但为了更好的降低基质效应的影响，确保结果的准确可靠，其余均采用基质加标曲线法。

2.5 方法的线性及范围

系列浓度混合标准曲线溶液经高分辨率质谱检测，以待测化合物的母离子峰面积(y)对其质量浓度(x)进行线性拟合，获得各待测化合物的线性方程。77种化合物在各自浓度区间范围内线性良好，变异系数R2均大于0.99。

2.6 检出限、准确度和精密度

采用逐级稀释加标样品至仪器能检出的最低含量为各化合物的仪器检出限，经过换算得到其方法检出限，并以方法检出限的3倍量为方法定量限，为0.6～48.0 μg/kg。取大米、小麦、植物油空白样品，进行了曲线最低点(低水平)、曲线第二低点(中水平)、曲线中间点(高水平)浓度水平的加标回收实验，每个浓度水平测定6个平行样品，对回收率进行了汇总统计，回收率在70.0%～120.0%的占95%以上；但桔霉素、细胞松驰素A在大米中的回收率仅为25%左右，嗜热菌杀酵母素、桔霉素、细胞松驰素A在小麦中的回收率为45%左右，可能是由于这两种基质所含淀粉、蛋白质较多，影响了它们的理化性质，从而导致其提取效果低下。对回收率精密度进行考察，RSD为0.1%～8.7%，说明方法具有良好的重复性。

2.7 实际样品检测

采用本实验方法对来自广西区内各地市的236批食用植物油样品进行检测，共检出5种真菌毒素，均为小油坊花生油样品，结果见表2。其中黄曲霉毒素B1和柄曲霉素的二级碎片离子见图4、图5。

图4 黄曲霉毒素B1在实际样品和标准溶液中的二级质谱图

图5 柄曲霉素在实际样品和标准溶液中的二级质谱图

黄曲霉毒素B1是植物油中常见的真菌毒素污染物，为自然界中理化性质最为稳定的一类霉菌毒素，被国际癌症研究机构确定为一级人类致癌物[19]。国家标准规定[20]，花生油中黄曲霉毒素B1限量为20 μg/kg，此次检出量为0.62～1 861.15 μg/kg，表明部分样品含量甚至达到了最大限值的90倍。这种情况的出现主要体现了生产者对真菌毒素危害性认知的缺失，以及小油坊仪器设备的局限。可见，对小油坊的日常监管工作有待加强，需进一步引导生产者从源头寻找、分析并避免引起真菌毒素超标的原因，特别是对原料进行严格的分拣、保证原料储藏的温湿度，并对生产设备进行日常的清洁、消毒；另一方面，也可以推广各种经验证有效、可行的降毒技术。

柄曲霉素最初分离于杂色曲霉培养物中，是黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1的合成前体，具有致癌性，被国际癌症研究机构划分为2B类致癌物[21]。我国现行国家标准中食品中杂色曲霉素的测定，仅适用于大米、玉米、小麦、黄豆及花生样品[22]，此次植物油中柄曲霉素的检出率为4.66%，含量为1.52～12.51 μg/kg，说明植物油中存在柄曲霉素的污染风险，有关部门需引起重视，必要时可对阳性样品进行溯源研究，同时进行风险评估甚至制订标准以填补监管空白。这也充分说明了本实验方法有利于发现粮油中真菌毒素污染情况的监管漏洞，可为粮油中真菌毒素污染防控提供技术支持。

经考察，仪器连续进样7 d，加标回收质控样品保留时间无偏差，峰面积稳定，且仪器污染程度较低，说明实验方法稳定性好，不会增加仪器的维护成本，可满足大批量、长时间的进样检测。

表2 236批植物油的检测结果汇总

3 结论

利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap)技术建立了一种直接提取、稀释进样，测定大米、小麦、植物油中77种真菌毒素的方法。本方法检测数量多，前处理简便高效。经方法学考察及实际样品检测证明，本方法实用性强，稳定性好，效率高，可满足国内外粮油中真菌毒素的高通量快速筛查和定量的要求。