热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠免疫机能的影响

魏可锋，李 可, 于忠芳, 冯玉祥, 苏 越，马卫明，闫振贵*

（1.山东省畜牧业贸易服务中心有限公司，山东 济南 250000；2.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安）

益生菌（probiotics）广泛存在于自然界和动植物体内，能分泌多种代谢产物，对宿主具有广泛的益生作用。枯草芽孢杆菌作为一种芽孢杆菌属益生菌，具有环境适应性强，安全性高，用途广泛等特点[1]。有研究表明，部分失去活性的益生菌仍能发挥活菌体原有的益生功能，并且在制备运输、安全性、临床应用等方面较活菌具备更大的优势，可广泛用于功能性食品、临床治疗、饲料添加等各个领域，具有极大的研究价值[2-3]。目前，日本、美国等对灭活益生菌的应用已形成了一定的产业规模[4]，而国内相关益生菌的研究则主要集中在活菌上，对灭活菌功能和应用的研究还比较少。因此，本研究利用热灭活枯草芽孢杆菌灌服小鼠，评估其对小鼠免疫机能的作用，为相关灭活益生菌制剂的开发和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株及动物 枯草芽孢杆菌，由山东青岛根源生物公司提供，批号 W161041；SPF级昆明种小鼠，体重 18～22 g，购自山东泰邦生物制品有限公司。

1.1.2 主要试剂及溶液 谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）生化试剂板购自北京安普生化有限公司；IL-2、IFN-γ ELISA 试剂盒由上海恒远生物科技有限公司提供；RIPA高效组织裂解液购自北京索莱宝公司、总 RNA提取试剂盒购自北京康为公司、M5 Super qPCR RT Kit、2×Fast Super EvaGreen® qPCR Mastermix购自US Everbright公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 灭活枯草芽孢杆菌菌液制备 枯草芽孢杆菌接种于 LB肉汤中，37 ℃ 振荡培养 12 h，培养 3代后用菌落平板计数法计算菌液浓度。随后在高压灭菌锅中灭活40 min，PBS重悬备用。

1.2.2 试验动物及分组 小鼠适应性喂养 3 d后随机分将成 5组，每组 4只，按照如下方式处理：空白对照组 BC（PBS），活菌对照组 VC（107CFU/ml活菌），低剂量（IV-L）、中剂量（IV-M）、高剂量（IV-H）灭活菌组（106、107、108CFU/ml灭活菌）。每只小鼠每天灌服菌液或PBS 0.3 ml，试验期间自由采食饮水，于灌胃7 d和14 d时处死小鼠，采集样品进行后续试验。

1.2.3 小鼠血清肝肾生化指标测定 眼眶采血后离心获取小鼠血清样本，使用生化分析仪检测样品血清ALT、BUN、CREA的含量。

1.2.4 小鼠全血淋巴细胞数及中性粒细胞数测定眼眶采血收集小鼠全血样本，使用三分类血球分析仪检测各样本淋巴细胞和中性粒细胞数。

1.2.5 小鼠脾指数测定 小鼠称重后在无菌环境中采集脾组织，清除表面结缔组织后称重。脾指数（%）= 脾重量（mg）/体重（g）×100 %。

1.2.6 小鼠血清细胞因子含量测定 收集小鼠血清样本，根据酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒说明书测定血清中IL-2和IFN-γ含量。

1.2.7 小鼠脾组织 IL-2 mRNA表达量的测定使用RNA提取试剂盒提取脾组织样本总RNA并将其反转录成 cDNA。随后使用 Light-Cycler 96荧光定量PCR仪扩增样本cDNA，评估溶解曲线并记录各反应Ct值。试验结果以2-△△ct值表示，β-actin为内参基因校准表达。反应条件为 95 ℃持续 30 s；40 个循环：95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s。引物序列为：IL-2 上游：5'-CTGGAGCAGCTGTTGATG-3'，下游：5'-CGA ATTGGCACTCAAATG-3'；β-actin 上游：5'-TGC TGTCCCTGTA TGCCTCT-3'，下游：5'-GGTCTT TACGGATGTCAACG-3'。

1.2.8 数据处理 试验结果以均值±标准差表示。组间比较使用 one-way ANOVA分析，并用Tukey's法检验。P<0.05代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠肝肾生化指标的影响

由表1可见，灌胃7 d与14 d时活菌组和灭活菌组的血清 ALT、BUN和 CREA含量未出现明显波动，且绝大部分试验组指标与 BC组无显著差异（P>0.05），表明试验周期内灭活枯草芽孢杆菌对小鼠肝肾生化指标无显著影响，具有较高的安全性。

表1 热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠血清ALT、BUN、CREA含量的影响（n=4）

2.2 热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠脾指数的影响

由图1可见，灌胃7 d时，IV-M组脾指数显著高于 BC组（P<0.05）；灌胃 14 d时，IV-L和IV-M组脾指数均高于BC和VC组，但差异不显著（P>0.05），表明中剂量灭活枯草芽孢杆菌提高小鼠脾指数效果较明显。

图1 各组脾指数的变化

2.3 热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠全血淋巴细胞数和中性粒细胞数的影响

由表2可见，灌胃7 d和14 d时，IV-M和IV-H组血液淋巴细胞数显著高于 BC组（P<0.05）；灭活菌各组中性粒细胞数均高于 BC组，且 IV-H组具有显著性（P<0.05）。这表明高剂量灭活枯草芽孢杆菌能有效提高小鼠血液中性粒细胞和淋巴细胞数。

表2 全血淋巴细胞和中性粒细胞数（×109个/L）（n=4）

2.4 热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠血清 IL-2和IFN-γ含量的影响

由图2可见，灌胃7 d和14 d时，IV-H组血清 IL-2含量显著高于 BC和 VC组（P<0.05）；与BC组相比，灌胃14 d时IV-L组血清IFN-γ含量显著升高（P<0.05），说明灌服相应浓度的热灭活枯草芽孢杆菌能显著促进小鼠血清中IL-2和IFN-γ的分泌。

图2 各组血清IL-2和IFN-γ含量变化

2.5 热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠脾组织 IL-2 mRNA表达水平的影响

由图3可见，灌胃7 d时，与BC组相比，IV-M、IV-H组和VC组IL-2 mRNA表达水平显著增加（P<0.05）；灌胃 14 d时，IV各组和 VC组 IL-2 mRNA水平均显著高于 BC组（P<0.05），这与血清IL-2含量的检测结果基本符合。

图3 各组小鼠IL-2 mRNA相对表达量的变化

3 讨论

近年来随着人们对枯草芽孢杆菌研究的深入，其更多的特性进入了人们的视野。有研究报道枯草芽孢杆菌能提高宿主机体免疫细胞的数量和活性，并激发后续的体液和细胞免疫，可作为一种良好的免疫激活剂[5]。益生菌的细胞壁成分、代谢产物、菌体细胞等均能刺激动物肠道黏膜免疫系统[6]，其中胞壁含有的肽聚糖和外膜蛋白以及菌体代谢产物中游离脂肪酸和细菌素等能增强小鼠巨噬细胞和B淋巴细胞活性，促进IL-2和 IFN-γ等免疫活性因子分泌[7]。此外，热灭活枯草芽孢杆菌还能刺激肠道黏膜中的B细胞活化，促进局部免疫球蛋白的分泌，增强免疫功能[8]。

免疫器官是机体免疫系统重要的组成部分，评估免疫器官发育情况可以间接评估机体免疫机能。脾脏作为机体内最大的外周免疫器官，是各种淋巴细胞和巨噬细胞的聚集地，血液中大部分抗原在此被捕获和处理[9]。另外，血液中的 T细胞、B细胞、NK细胞等淋巴细胞是机体重要的免疫细胞，它们在发挥体液免疫、细胞免疫、免疫信号传导和调控等方面发挥重要的作用。此外，细胞因子在机体免疫反应过程中同样具有重要的作用。研究表明，部分细胞因子能参与T细胞的激活，后者又能促进多种细胞因子的分泌，构成机体复杂的免疫调控网络[10]。在这些细胞因子中，IL-2能刺激 B细胞增殖、分化和抗体分泌，诱导 NK和 LAK等多种杀伤细胞活化[11]。IFN-γ 则能提高巨噬细胞和 NK 细胞的活性，增强IgG Fc片段受体表达。检测这些细胞因子的分泌和表达有助于评估机体的免疫应答水平。

本试验首先对热灭活枯草芽孢杆菌的安全性进行了评估，避免后续试验对宿主产生毒害作用。与先前报道一致，枯草芽孢杆菌安全性高，对宿主机体无明显毒害作用[12]。随后检测了多种免疫相关指标，来探究热灭活枯草芽孢杆菌对小鼠免疫机能的作用。结果显示，热灭活枯草芽孢杆菌提高了小鼠脾指数、全血免疫细胞数和细胞因子表达分泌量，对小鼠免疫机能起到有益的调节作用。有趣的是，在部分指标中，灭活菌相较活菌具有更显著的益生作用，可能的原因是灭活菌液中枯草芽孢杆菌以芽孢体为主，芽孢体形态的细菌表面有更多的抗原位点，能被机体免疫细胞更迅速的识别，从而引起广泛和高效的免疫反应[13]。此外，枯草芽孢杆菌在疫苗佐剂方面同样具有应用价值。邓军发现传染性胃肠炎病毒疫苗中加入枯草芽孢杆菌可以使仔猪血清中特异性抗体额外增加[14]。尽管关于枯草芽孢杆菌是否能用于免疫佐剂和口服疫苗尚无明确定义，但枯草芽孢杆菌及其灭活微生态制剂具有的免疫调节作用值得关注。

4 结论

本研究表明，热灭活枯草芽孢杆菌能通过提高小鼠脾指数、全血免疫细胞数和细胞因子表达分泌量等方式发挥免疫增强作用，可能是一种安全有效的免疫增强剂。然而，由于动物模型的限制，热灭活枯草芽孢杆菌免疫增强的具体作用机制有待进一步研究。