血塞通咀嚼片质量标准研究

蒋 蒨 周 旭 谭茂兰 林泉松 陈知孜

重庆科瑞制药(集团)有限公司，重庆 400060

血塞通咀嚼片是由三七总皂苷加适量赋形剂制成的片剂，具有活血祛瘀、通脉活络的功能。用于脑络瘀阻、中风偏瘫、心脉瘀阻、胸痹心痛；脑血管病后遗症、冠心病心绞痛等属上述证候者。

在血塞通咀嚼片质量标准中，三七总皂苷含量的测定方法为紫外分光光度计比色法，其结果存在虚高现象；采用HPLC法，对产品中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1进行了含量测定，但未控制人参皂苷Re和人参皂苷Rd。因此，参考有关资料[1-2]，本文对标准中含量测定项下的紫外分光光度计比色法和UHPLC法进行了研究、优化。实验结果证明，采用的方法科学合理，结果准确、可靠，进一步提高了该产品的质量控制水平。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津UV-2600紫外测定仪，超高效液相色谱仪(Waters Aquity UPLC H-class)，BS124S电子天平(万分之一，Sartorius)，XS105(十万分之一，Metter Toledo)。

1.2 材料 对照品人参皂苷Re(批号：110754-201626)、三七总皂苷(批号：110870-201603)购于中国食品药品检定研究院。血塞通咀嚼片[重庆科瑞制药(集团)有限公司，批号：171201、171202、171203]。甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，正丁醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 三七总皂苷的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取人参皂苷Re对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每 1 mL 含0.32 mg的溶液，即得。

2.1.2 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液 3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取上述系列对照品溶液2 mL，分别置10 mL试管中，在水浴上蒸干，冷却至室温，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL，加高氯酸0.8 mL，在70 ℃水浴中显色 15 min，放冷，精密加入冰醋酸5 mL，摇匀，以相应的试剂为空白。照紫外-可见分光光度法，在550 nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程A=10.3699C+0.0002(r=0.9997)。在0.0941～0.2197 mg/mL浓度范围内，人参皂苷Re的浓度与紫外吸收值线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品适量(约相当于含三七总皂苷50 mg)，精密称定，置50 mL量瓶中，加正丁醇，超声处理30 min，放冷，用正丁醇定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 4 mL，置蒸发皿中，挥干，加甲醇溶解，转移置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.4 测定法精密量 取供试品溶液2 mL，置10 mL试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“在水浴上蒸干”起，依照测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中人参皂苷Re的浓度，计算，即得。

2.1.5 专属性试验 取辅料适量，按供试品溶液制备方法项下操作，由实验结果可得，在550 nm处，辅料对制剂含量的影响小于2%，可判定为不干扰血塞通咀嚼片三七总皂苷的含量检测。

2.1.6 精密度试验 取对照品6份，按对照品溶液制备方法项下操作，吸光度的RSD=0.77%(n=6)，该方法精密度良好。

2.1.7 重复性试验 取供试品供6份(171202批)，按供试品溶液制备方法项下操作，平均含量为50.35 mg/片，RSD=0.98%(n=6)，该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取供试品溶液,于不同时间间隔取出，测定吸光度，供试品溶液在 4 h 内稳定。

2.1.9 加样回收试验 取约相当于含三七总皂苷 25 mg 的供试品共6份，精密称定，精密加入的人参皂苷Re对照品25 mg，按供试品溶液制备方法项下操作，由实验结果可的，血塞通咀嚼片三七总皂苷的回收率在95.0%～103.0%之间，RSD=2.14%(n=6)，该方法具有较好的回收率，准确度良好。

2.1.10 样品测定 取3批样品，按上述方法检测。结果见表1。

表1 样品测定结果

2.2 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及人参皂苷Rd的测定

2.2.1 色谱条件 采用UHPLC法进行含量测定，色谱柱为Infinity Lab 120EC-C18(2.7 μm，4.6 mm×100 mm)，柱温为25 ℃，流动相为乙腈(A)和水(B)，梯度洗脱(0～6 min，21%A；6～13.5 min，21%A→46%A；13.5～16.5 min，46%A→55%A；16.05～18 min，55%A)，流速为1.5 mL，检测波长为203 nm，进样量为10 μL。在上述色谱条件下，对照品、样品色谱图如图1所示。

1：三七皂苷R1；2：人参皂苷Rg1；3：人参皂苷Re；4：人参皂苷Rb1；5：人参皂苷Rd图1 专属性试验液相色谱图

2.2.2 溶液的制备 取三七总皂苷对照品适量，精密称定，加70%甲醇溶解并稀释制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得对照品溶液。取重量差异项下的本品，研细，精密称取适量(约相当于含三七总皂苷62.5 mg)，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100 W，频率40 kHz)40 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 专属性试验 取血塞通咀嚼片空白混合辅料(按处方配比)适量，按供试品溶液制备方法处理。精密量取供试品溶液、空白辅料溶液和对照溶液各10 μL，照上述色谱条件测定，由图1可知，空白辅料溶液峰在主峰位置无吸收峰，空白辅料对含量测定无干扰，供试品溶液中5种成分人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re及人参皂苷Rd的保留时间与对照品溶液中5种成分的保留时间一致。

2.2.4 精密度试验 取对照溶液10 μL，照上述色谱条件测定，连续进样 6 次。测得人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re及人参皂苷Rd 峰面积的RSD分别为0.13%、0.18%、 0.14%、0.70%和0.08%，表明仪器进样精密度良好。

2.2.5 线性关系考察 取三七总皂苷对照品适量，制备相当于供试品溶液浓度20%、60%、100%、140%、180%的线性溶液。照上述色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积相对浓度进行线性回归计算，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re及人参皂苷Rd的回归方程分别为：A=1658.7758C+9832.2500(r=0.9999)，A=2270.0437C-7360.4500(r=0.9999)，A=1747.7460C-1962.0000(r=0.9999)，A=2110.2390C-3142.4000(r=0.9997)，A=1841.9932C-916.3000，r=0.9999。结果表明，人参皂苷Rb1在139.8296～1258.4664 μg/mL，人参皂苷Rg1在1132.7624～1194.8616 μg/mL、三七皂苷R1在37.3552～336.1968 μg/mL、人参皂苷Re在18.6776～168.0984 μg/mL及人参皂苷Rd在38.3648～345.2832 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批供试品(171202批)，按“2.2.2溶液的制备”项下方法，制备相当于供试品溶液浓度80%、100%和120%的样品溶液各3份，照上述色谱条件测定，9份样品溶液中人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd以及总皂苷平均含量分别为15.45%、15.76%、4.74%、2.11%、4.26%以及42.33%，RSD%分别为0.31%、0.24%、0.29%、0.34%、0.74%以及0.29%，该方法的重复性良好。

2.2.7 加样回收试验 取重量差异项下的本品，研细，精密称取适量(约相当于含三七总皂苷31 mg)，置具塞锥形瓶中，精密称取三七总皂苷原料药(批号：170702)适量至同一具塞锥形瓶中，配制相当于供试品浓度80%、100%与120%的样品，各浓度平行制备3份，按“2.2.2溶液的制备”项下方法制备样品溶液，照上述色谱条件测定，并分别计算回收率，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd以及总皂苷平均回收率分别为97.2%、98.0%、97.5%、98.4%、98.2%以及97.7%，RSD%分别为0.40%、0.20%、0.16%、0.44%、0.19%以及0.24%，该方法的重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一批供试品溶液，在室温放置，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h照上述色谱条件测定，由试验结果可得，供试品溶液中各成分RSD均小于2%，表明供试品溶液中各成分在室温条件下12 h内均稳定。

2.2.9 样品测定 取3批样品，按“2.2.2溶液的制备”项下方法制备样品溶液，照上述色谱条件测定。结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

3.1 对照品的选择 三七总皂苷是由一系列四环三萜类衍生物组成，为一个多组分的复杂体系。其含量检测的原理主要是利用三七总皂苷分子上的糖基能被浓硫酸氧化脱水成糠醛衍生物，从而与香草醛发生显色反应。血塞通咀嚼片中三七总皂苷含量测定方法中原对照品为 “三七总皂苷对照品”，由于三七总皂苷为混合物，其成分组成、含量比例的不一致造成血塞通咀嚼片中三七总皂苷检测含量偏高，而选取其中的主要成分人参皂苷 Re作为检测指标，检测结果更接近理论含量，且成本更低，更易获取，同时根据实验结果可知，采用人参皂苷 Re为对照品更合理，可行性更高。

3.2 提取溶剂的选择 在血塞通系列制剂中[3]，供试品的提取溶液一般采用乙醇、甲醇，而血塞通咀嚼片中所用的辅料可能会被乙醇、甲醇提取，与显色剂发生反应，从而对含量结果造成影响；根据相关资料[4]，三七总皂苷能在正丁醇中溶解，而血塞通咀嚼片所用辅料难溶于正丁醇，如果采用该溶剂，可能在保证完全提取三七总皂苷的前提下，排除辅料对含量测定结果的影响。

在血塞通咀嚼片的原质量标准中，主要对人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1三种主要成分采用HPLC方法进行了含量测定；而在中国药典2020年版一部收载的三七总皂苷质量标准中对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd 5种成分进行了检测。因此，笔者增加了人参皂苷Re和人参皂苷Rd的含量测定，将原测定3种主要成分增加为测定5种，同时由于药典中HPLC方法运行时间较长，试验对液相色谱方法进行了修改，采用超高效液相色谱法，对色谱柱和流动相比例进行了优化筛选，在保证准确测定5个主要成分的前提下，使样品的检测时间由1 h缩短为30 min，提高了工作效率的同时，降低了检测成本和环境污染。