踝节菌属真菌、胶孢炭疽菌化学成分的研究

魏汉楠， 杨中铎， 张义飞， 苟文博， 吕 敏， 张 干， 王 丽

(兰州理工大学，甘肃 兰州 730050)

内生真菌广泛存在于植物中，与宿主形成了和谐的共生关系，为宿主提供保护。踝节菌属真菌Talaromyces又称为篮状菌，是一种在海洋和陆地中广泛分布的真菌。研究发现，踝节菌属的内生真菌能够代谢出很多结构新颖的化合物[1]。因此，本研究对踝节菌属真菌Talaromycesaurantiacus在燕麦片培养基下发酵得到的次级代谢产物进行化学成分研究，从中分离到4个化合物，其中化合物10～11为首次从踝节菌属真菌T.aurantiacus分离。本课题组之前从植物钩藤中分离得到了内生真菌ColletotrichumgloeosporioidesGT-7(GenBank收录号KR911618)，经过测定发现其PDB培养基的发酵产物对单胺氧化酶拥有较高的活性，IC50值为17.79 μmol/L，通过活性跟踪，发现了4个结构新颖的酰胺类化合物colletotrilactam A～D[2]。为了能够得到更多结构新颖的化合物，本研究选用绿豆固体培养基对该真菌进行发酵，研究其化学成分，从中分离到7个化合物，其中化合物4～7为首次胶孢炭疽菌C.gloeosporioides分离得到。

1 材料

1.1 仪器 YXQ-SG46-280SA型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅、HPX-9162MBE型数显电热培养箱(上海博讯实业有限公司)；JJ-CJ-ID型超净工作台(杭州净化设备厂)；SHZ-82型恒温震摇箱(常州国华电器有限公司)；RE-5286A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；NP7000C型高效液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)；YMC-Pack ODS-A色谱柱(10 mm×250 mm，5 μm，日本YMC公司)；0.45 μm微孔过滤器(美国Gibco公司)。

1.2 试剂 乙酸乙酯(工业纯，兰州西固永达化工厂)；甲醇(色谱纯，天津康科德科技有限公司)。

1.3 菌株 钩藤内生真菌ColletotrichumgloeosporioidesGT-7(GenBank收录号KR911618)由课题组前期从钩藤中分离得到，保存于兰州理工大学生命科学与工程学院。踝节菌属真菌Talaromycesaurantiacus购自中国微生物菌种查询网(http://www.biobw.org)，菌株编号bio-81655，保存于兰州理工大学生命科学与工程学院。

2 提取与分离

2.1 胶孢炭疽菌 将菌种接种至PDA培养基后，在28 ℃恒温培养箱中培养7 d，作为种子培养基，培养完成后接种至121 ℃高压灭菌30 min的绿豆培养基中(500 mL锥形瓶中加入80 g绿豆、100 mL蒸馏水)，在28 ℃下培养45 d，其间定期喷洒医用酒精进行杀菌。将发酵完全的绿豆培养基晒干后研磨成粉，以乙酸乙酯浸泡提取，得发酵物粗浸膏25 g，经大孔吸附树脂柱层析，乙醇-水(1∶9～9∶1)梯度洗脱，得Fr.A～Fr.E。

Fr.A(2.1 g)经MCI柱层析，甲醇-水(2∶8～1∶0)梯度洗脱，得Fr.A-1～Fr.A-4，Fr.A-2(523 mg)经硅胶柱层析，氯仿-甲醇(50∶1～2∶1)梯度洗脱，得化合物1(27 mg)。Fr.B(1.4 g)经硅胶柱层析，氯仿-甲醇(100∶1～10∶1)梯度洗脱，得化合物2(15 mg)、Fr.B-2，Fr.B-2(350 mg)经硅胶柱层析，氯仿-甲醇(150∶1～50∶1)梯度洗脱，得化合物3(3 mg)、4(4.1 mg)。Fr.C(2.2 g)经MCI柱层析，甲醇-水(2∶8～1∶0)梯度洗脱，得Fr.C-1～Fr.C-4，Fr.C-1(355 mg)经硅胶柱层析，石油醚-丙酮(100∶1～5∶1)梯度洗脱，得化合物5(3.2 mg)、6(2.7 mg)；Fr.C-4(120 mg)经硅胶柱层析，石油醚-丙酮(150∶1～20∶1)梯度洗脱，得化合物7(2.8 mg)。

2.2 踝节菌属真菌 将菌种接种至PDA培养基后，在28 ℃恒温培养箱中培养7 d，作为种子培养基，培养完成后接种到121 ℃高压灭菌30 min的燕麦片培养基中(500 mL锥形瓶中加入80 g燕麦片、100 mL蒸馏水)，在28 ℃下培养45 d，其间定期喷洒医用酒精进行杀菌，发酵完成后取出燕麦片培养基，风干后研磨成粉，乙酸乙酯浸泡提取，得粗浸膏21 g，经大孔吸附树脂柱层析，乙醇-水(1∶9～9∶1)梯度洗脱，得Fr.FTy-A～Fr.JTy-E。

Fr.GTy-B(1.2 g)经硅胶柱层析，氯仿-甲醇(150∶1～20∶1)梯度洗脱，得Fr.G-1～Fr.G-3，Fr.G-1(111 mg)经半制备HPLC，58%甲醇洗脱，得化合物11(3.5 mg，tR=31 min)；Fr.G-2(173 mg)经硅胶柱层析，石油醚-丙酮(200∶1～20∶1)梯度洗脱，得化合物9(3.1 mg)；Fr.G-3(163 mg)经半制备HPLC，43%甲醇洗脱，得化合物10(3.5 mg，tR=27 min)。Fr.H(2.3 g)经MCI柱层析，甲醇-水(2∶8～1∶0)梯度洗脱，得Fr.H-1～Fr.H-5，Fr.H-3(232 mg)经半制备HPLC，65%甲醇洗脱，得化合物8(2.2 mg，tR=33 min)。

3 结构鉴定

化合物1：针状结晶，ESI-MSm/z：170.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.96(2H，Sh-2/6)，9.18(3H，brs，3，4，5-OH)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：120.2(C-1)，109.1(C-2)，144.7(C-3)，138.4(C-4)，109.1(C-6)，166.5(C-7)，以上数据与文献[3]基本一致，故鉴定为没食子酸。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z：340.6[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：2.52(2H，t，J=5.4 Hz，H-2)，2.34(2H，m，H-3)，1.20(3H，t，J=6.9 Hz，H-22)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：129.9(C-1)，35.9～22.7(多个CH2信号)，14.1(C-22)，以上数据与文献[4]基本一致，故鉴定为behenic acid。

化合物3：白色晶体，ESI-MSm/z：122.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.76(1H，s)，7.79(2H，d，J=8.0 Hz)，6.92(2H，d，J=8.0 Hz)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：129.2(C-1)，132.1(C-2)，116.7(C-3)，164.1(C-4)，116.7(C-5)，132.1(C-6)，192.5(-CHO)，以上数据与文献[5]基本一致，故鉴定为对羟基苯甲醛。

化合物4：白色无定型粉末，ESI-MSm/z：189.2[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.75(1H，s)，8.32(1H，d，J=8.2 Hz)，7.28(2H，t，J=8.2 Hz)，7.50(1H，d，J=8.2 Hz)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：138.1(C-2)，111.7(C-3)，126.5(C-3a)，121.5(C-4)，122.9(C-5)，123.9(C-6)，112.5(C-7)，136.5(C-7a)，181.7(C-8)，166.7(C-9)，以上数据与文献[6-7]基本一致，故鉴定为(1H-indol-3-yl)oxoacetamide。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z：411.5[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：5.87(1H，d，J=9.5 Hz)，4.43(1H，dd，J=6.8，6.9 Hz)，2.49(1H，m)，1.99(1H，m)，1.66(3H，s)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：130.0(C-2)，50.2(C-3)，166.2(C-5)，58.7(C-6)，29.2(C-7)，22.6(C-8)，45.3(C-9)，171.0(C-11)，83.0(C-12)，68.7(C-13)，105.5(C-14)，120.8(C-15)，121.3(C-16)，109.9(C-17)，156.8(C-18)，95.1(C-19)，137.6(C-20)，124.0(C-21)，134.6(C-22)，25.7(C-23)，18.3(C-24)，55.8(-OCH3)，以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为12，13-dihydroxy fumitremorgin C。

化合物6：无定型浅黄色粉末，ESI-MSm/z：358.4[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.21(1H，s，-NH)，7.54(1H，d，J=7.9 Hz，H-7)，7.67(1H，t，J=7.9 Hz，H-8)，7.43(1H，t，J=8.0 Hz，H-9)，8.26(1H，d，J=8.0 Hz，H-10)，5.58(1H，dd，J=5.5，3.2 Hz，H-14)，3.55(1H，dd，J=15.0，5.5 Hz，H-15)，3.61(1H，dd，J=15.0，3.2 Hz，H-15)，1.35(3H，s，H-16)，6.71(1H，Hs，H-18)，8.15(1H，brs，H-19)，7.31(1H，brd，J=8.0 Hz，H-21)，7.13(1H，t，J=8.0 Hz，H-22)，6.91(1H，t，J=8.0 Hz，H-23)，7.39(1H，d，J=8.0 Hz，H-24)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：169.2(C-1)，47.1(C-3)，150.6(C-4)，161.7(C-12)，55.5(C-14)，27.1(C-15)，19.0(C-16)，108.4(C-17)，122.5(C-18)，134.9(C-20)，110.1(C-21)，120.1(C-23)，以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为fumiquinazoline F。

化合物7：ESI-MSm/z：154.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.55(3H，s，H-8)，6.47(1H，d，J=9.4 Hz，H-4)，8.38(1H，s，H-2)，7.92(1H，d，J=9.4 Hz，H-5)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：145.7(C-2)，112.7(C-3)，141.7(C-4)，119.3(C-5)，176.2(C-6)，176.3(C-7)，38.6(C-8)，以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为1，6-dihydro-1-methyl-6-oxo-3-pyridinecarboxylic acid。

化合物8：淡黄色固体，ESI-MSm/z：564.6[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：9.53(1H，s，9′-OH)，9.47(1H，s，9-OH)，6.45(2H，d，J=1.8 Hz，H-7,7′)，6.11(1H，d，J=1.8 Hz，H-5′)，5.98(1H，d，J=1.8 Hz，H-5)，5.16(1H，d，J=15.7 Hz，C-1)，4.72(1H，d，J=15.7 Hz，C-1)，4.75(1H，d，J=15.7 Hz，C-1′)，4.63(1H，d，J=15.7 Hz，C-1′)，4.02(3H，s，8-OCH3)，4.00(3H，s，8′-OCH3)，3.80(1H，s，H-4)，3.77(1H，s，H-4′)，3.46(3H，s，6-OCH3)，1.23(3H，d，J=6.5 Hz，H-11)，1.21(3H，d，J=6.5 Hz，H-11′)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：157.7(C-6)，154.5(C-6′)，157.6(C-8)，157.4(C-8′)，136.1(C-10a)，136.1(C-10a′)，123.9(C-10)，123.1(C-10′)，110.3(C-8a)，109.8(C-8a′)，73.8(C-3)，74.0(C-3′)，66.5(C-4)，65.0(C-1)，64.5(C-1′)，56.3(-OCH3)，56.2(-OCH3)，55.2(-OCH3)，16.9(C-11)，16.8(C-11′)，以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为6′-O-desmethylES-242-4。

化合物9：无色针晶，ESI-MSm/z：428.7[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：3.94(1H，m，H-3)，6.50(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，0.88(3H，s，H-18)，1.09(3H，s，H-19)，1.0(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，5.11(1H，dd，J=6.6，15.2 Hz，H-22)，5.19(1H，dd，J=7.6，15.1 Hz，H-23)，0.83(3H，d，J=5.0 Hz，H-26)，0.82(3H，d，J=5.0 Hz，H-27)，0.89(3H，m，H-28)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：34.7(C-1)，30.1(C-2)，66.4(C-3)，36.9(C-4)，82.1(C-5)，135.4(C-6)，130.7(C-7)，79.4(C-8)，51.1(C-9)，36.9(C-10)，23.4(C-11)，39.3(C-12)，44.5(C-13)，51.7(C-14)，20.6(C-15)，28.6(C-16)，56.2(C-17)，12.9(C-18)，18.1(C-19)，39.7(C-20)，20.9(C-21)，135.2(C-22)，132.3(C-23)，42.8(C-24)，33.0(C-25)，19.6(C-26)，19.9(C-27)，17.5(C-28)，以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为麦角甾醇过氧化物。

化合物10：ESI-MSm/z：484.5[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：7.16(1H，d，J=10.3 Hz，H-1)，6.00(1H，d，J=10.3 Hz，H-2)，2.18(1H，dd，J=14.0，4.6 Hz，H-5)，1.85，2.2(2H，dd，J=14.0，2.4 Hz，H-6)，4.18(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-7)，2.27(2H，dd，J=14.0，5.0 Hz，H-9)，2.62(2H，dd，J=15.0，5.0 Hz，H-11)，1.27(1H，s，H-12)，1.1(3H，s，H-13)，1.12(3H，s，H-14)，1.36(3H，s，H-15)，6.50(1H，s，H-5′)，6.17(1H，d，J=1.7 Hz，H-7′)，1.49(3H，d，J=6.6 Hz，H-9′)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：156.2(C-1)，127.5(C-2)，203.7(C-3)，44.6(C-4)，42.4(C-5)，26.5(C-6)，71.8(C-7)，79.7(C-8)，41.8(C-9)，38.4(C-10)，21.5(C-11)，21.5(C-12)，21.4(C-13)，27.7(C-14)，27.4(C-15)，102.2(C-1′)，135.8(C-2′)，112.3(C-3′)，162.2(C-4′)，106.3(C-5′)，159.6(C-6′)，64.1(C-7′)，76.0(C-8′)，16.4(C-9′)，168.8(C-10′)，以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为thailandolides B。

化合物11：ESI-MSm/z：372.4[M+H]+。1H-NMR(CDCl3，600 MHz)δ：0.96(3H，d，J=14.5 Hz，5′-CH3)，0.99(3H，d，J=6.1 Hz，4′-CH3)，1.67(1H，dd，J=14.5，8.9 Hz，2′-CH2)，1.79(1H，m，3′-CH)，2.24(3H，s，H-9′)，3.98(3H，s，4-OCH3)，5.07(3H，m，H-1′)，6.37(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.85(1H，d，J=1.8 Hz，H-10)，6.87(1H，d，J=8.5 Hz，H-1)，7.56(1H，d，J=8.5 Hz，H-2)；13C-NMR(CDCl3，150 MHz)δ：117.7(C-1)，131.0(C-2)，136.8(C-3)，154.3(C-4)，119.4(C-5)，167.9(C-6)，69.1(C-7)，125.7(C-7a)，120.6(C-8)，134.9(C-9)，117.7(C-10)，147.5(C-11)，141.3(C-11a)，151.3(C-12a)，66.6(C-1′)，47.6(C-2′)，24.9(C-3′)，21.8(C-4′)，23.3(C-5′)，62.6(4-OCH3)，20.8(9-CH3)，以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为penicillide。

4 讨论

药用真菌是天然药物发现的重要微生物资源宝库，我国真菌资源种类丰富，但多种资源尚待发现，且大多数真菌主要来源于自然野生资源，其可持续利用面临挑战。本研究从胶孢炭疽菌C.gloeosporioides绿豆培养基发酵产物中得到7个单体化合物，其中，化合物4～7为首次从该真菌中分离得到。从踝节菌属真菌T.aurantiacus的燕麦片培养基发酵产物得到4个单体化合物，其中化合物10～11均为首次从该菌中发现。此次分离得到的化合物与同一菌种代谢产物有所不同，可能是由于菌种来源以及培养条件不同对基因表达产生影响，导致其代谢产物的差异，而且植物内生菌自身种类的多样性和代谢途径的多样性也决定了其次级代谢产物的丰富多样，今后可以通过改变培养基以及表观遗传修饰等手段进行优化。在下一步研究中，本课题组将对本研究分离得到的化合物进行活性筛选。目前，国内外对药用真菌次级代谢产物的研究相对较少，本研究不仅丰富了药用真菌化学成分的多样性，也为从药用真菌中发现更多具有生物活性的新颖结构化合物提供了科学依据。