单纯疱疹病毒疫苗的研究进展

梁子腾 综述，黄维金，王佑春 审校

1.中国食品药品检定研究院 国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法与标准化重点实验室 国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室，北京 102629；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730

近年来，流行病学调查显示，由于人类感染单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）而导致的口唇疱疹、咽炎、生殖器疱疹等疾病的发病率仍处于高位。HSV 包括HSV-1 和HSV-2 两种血清型［1］。目前每年约有1.4 亿人感染HSV-1，5 亿人感染HSV-2［2］，且病例数呈逐年上升趋势。HSV-1 和HSV-2 均属于疱疹病毒家族中的α 亚科，是具有包膜结构的双链DNA病毒。HSV-1的基因组长度为125 000 ～240 000 bp，主要引起口、面部、咽部感染，严重者可表现为散发性脑炎等重大疾病。有文献报道，HSV-1 减毒活疫苗VC2在生殖器疱疹豚鼠模型中提供了对HSV-2生殖器感染的保护，疫苗在2个HSV血清型间有一定的交叉保护作用［3］。HSV-2的基因组长度为154 000 bp，主要导致生殖器疱疹，每年报告的HSV-2感染新病例约为2 300万［4］。有研究表明，HSV-2感染者艾滋病的发病率显著增加［2］，且对于女性患者，与宫颈癌的发生也密切相关［5］。由于HSV独特的感染特点和免疫逃逸机制，且目前全球范围内尚无HSV疫苗获批上市，因此，研发HSV疫苗显得尤为重要。本文对国内外HSV疫苗的研究进展及其研制过程中可能存在的局限性作一综述。

1 HSV感染及特点

HSV 的感染分为原发性感染、潜伏感染与复发，原发性感染即患者在感染HSV 后，该病毒在感染的组织及其周围增殖，形成的病灶为原发性感染灶［5］。之后，病毒通过神经细胞轴突向感觉神经节传递形成潜伏性感染。有学者认为，HSV 潜伏感染时，其基因组的结构和功能均完好无损，只是暂停了病毒基因的转录和表达相关的一系列调控［6］。HSV 增殖后，最终以核衣壳的形式存在于被根神经节。当受到外界环境（紫外线照射或化学物质刺激等）影响时，可引起HSV 的复发感染。目前已知的HSV 上有12种糖蛋白：gB、gC、gD、gE、gG、gI、gH、gJ、gK、gL、gM和gN［7］。研究者基于HSV 的生物学特点、潜伏感染的机制等开发改造HSV疫苗。

根据病毒的感染特点，HSV疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗的接种对象是健康人群，防止病毒的入侵，主要针对HSV的原发性感染，在皮肤和黏膜表面建立病毒防御，阻止病毒向感觉神经节的入侵，抑制病毒形成潜伏性感染。治疗性疫苗的接种对象是已被病毒感染的人群，目的是缓解患者的临床症状，达到治疗或防止病情恶化的效果。

2 HSV疫苗

HSV疫苗按照其特点、形成和作用机理，可分为减毒活疫苗、核酸疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程活病毒疫苗、合成肽疫苗和抗独特型疫苗，见表1。有文献表明，抗独特型疫苗可在一定程度上抵抗HSV的入侵［8］，但也有实验表明，抗独特型疫苗并未起到明显作用，反而增强了HSV的致病能力［9］，之后对该类疫苗鲜有报道。

表1 HSV疫苗临床试验状态Tab.1 Clinical trials of HSV vaccines

2.1 减毒活疫苗 减毒活疫苗删除了病毒的致病基因，使其毒性减弱，接种后可刺激机体体液及细胞免疫应答，部分还可引起黏膜免疫，由于其副作用小，安全性高［8］等特点，HSV 减毒活疫苗的研发被寄予厚望，但其安全性还与宿主的机体免疫力、毒株本身返祖而重新获得致病力［10］密切相关。

最初，TK基因是研发减毒活疫苗的首选基因，在HSV-1F基因中敲除一段基因得到2 个基因重组体R7017和R7020，在动物试验中也证明了该疫苗是安全有效的［10］。1999年，一种删除核糖核酸酶PK基因的ICPΔ10基因缺陷活病毒疫苗被评价为是能够预防HSV-2 感染的潜在疫苗［11］，使用ICPΔ10PK 疫苗免疫小鼠后，可观察到小鼠体内产生了针对HSV的特异性抗体。在WACHSMAN 等［12］构建的豚鼠模型中，注射ICPΔ10PK 疫苗的豚鼠，其潜伏感染神经节比例、原发感染和复发感染比例以及生殖器疱疹感染与复发比例均显著低于使用PBS 等剂量注射的对照组，表明ICPΔ10PK 疫苗在豚鼠体内具有预防和治疗作用。减毒活疫苗HSV529 目前正在进行Ⅱ临床实验。HSV-2 的UL5和UL29基因被敲除，获得了HSV-2 的突变株dl5-29。YO 等［13］用已构建的HSV-1血清阳性和阴性的豚鼠模型检测dl5-29 与gD 疫苗对豚鼠的保护效力，结果发现，经wild HSV 对豚鼠阴道刺激后，dl5-29 组豚鼠的神经节HSV DNA 水平更低，且诱导的中和抗体滴度较高。DELAGRAVE等［14］比较了肌内注射HSV529 与gD 疫苗在不同攻毒剂量下的保护作用，试验结果与YO等的结果一致。研究发现，删除UL22基因的非感染性单周期病毒，HSV 的gH 糖蛋白不能正常合成［15-16］，导致病毒不能感染正常的细胞，该疫苗安全性良好，但无法完全阻止HSV-2 的潜伏与复发。近几年的一项研究中，STANFIELD 等［17］利用HSV gK 蛋白和2 个截短突变的UL20基因构建了HSV VC2减毒活疫苗，该减毒疫苗株能在豚鼠体内产生强烈的免疫应答，小鼠肌肉注射VC2可引发广泛的黏膜免疫反应。

2.2 核酸疫苗 核酸疫苗与传统疫苗不同，其具有性能稳定、安全性高、成本低、在细菌中可大量增殖和广泛诱导免疫应答等特点，是目前最新发展的疫苗之一［18］。核酸疫苗是将编码某种病毒蛋白的质粒接种于人体内，之后在体内转录翻译生成蛋白质，刺激机体产生免疫应答。目前研究较多的是DNA 疫苗。由于糖蛋白D2（glycoprotein，gD2）和gB2 是诱导免疫反应的主要抗原，HSV DNA 疫苗大多采用gD2 和gB2［18］。有资料显示，联合表达HSV gD、gB 的疫苗起到的保护效果优于单一表达其中一种糖蛋白［19］。

2008年，一种候选HSV-2 gD2 DNA 疫苗在HSV-2 血清阴性的62 名健康成年人中进行了载体对照、双盲、剂量递增免疫原性和安全性试验，且其中50%的受试者还是HSV-1 阴性，全部受试者被随机分配到疫苗组和安慰剂组，比例为4∶1。实验结果表明，疫苗安全性良好，未观察到剂量依赖的毒性，但仅在3 000 μg 剂量组中一名受试者检测到对gD2 的细胞免疫，提示该疫苗需高剂量接种可能才会发挥其更好的性能［19］。ZHOU 等［20］开发了一种编码HSV-2 gD的gD2 DUL25 DNA 疫苗，该疫苗与传统的gD2 疫苗相比，能诱导更强烈的免疫应答。之后又在gD2 DUL25 DNA 疫苗上进行了改造，IL-28佐剂的加入使体液免疫和细胞免疫得到进一步加强。KIM 等［21］也将gD 作为核酸疫苗的主要靶点，为了促进细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）反应，又选择了有CD8 T 细胞特异性表位的UL25 和gB 蛋白作为额外的靶点，结果表明，该疫苗诱导了病毒特异性T 细胞应答，并较好地清除了HSV，起到了预防HSV原发性感染的作用。PACK 等［22］发现，热休克蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70）与病毒MHCⅠ级限制性表位（gB498-505）耦合疫苗可保护新生小鼠免受HSV-1 感染，可在生命早期抵抗HSV 的攻击。DUTTON 等［23］通过对密码子优化修饰来增强免疫应答，并在此基础上增加泛素编码序列将抗原靶向到蛋白酶体中进行处理，从而构建了编码HSV gD 的新型DNA 疫苗，在小鼠体内注射后，细胞毒性T细胞应答显著增强，并降低了病毒潜伏感染的风险。还有多种新型DNA 疫苗，如gD2、gB2、CTL 表位质粒DNA疫苗，可成功刺激机体产生广泛的免疫应答［23-27］。

2.3 灭活疫苗 第一代灭活疫苗是通过用福尔马林处理被HSV 感染的兔脑等动物组织而制备的［28］。第二代灭活疫苗是将HSV接种于鸡胚，用紫外线照射或化学处理等方法灭活鸡胚中的病毒，进而制成疫苗。目前的灭活疫苗是通过细胞培养HSV，灭活后进行一系列纯化等制备的。据文献报道，Lupidon G和Lupidon H是全病毒灭活疫苗的两个代表性疫苗，在意大利曾进行Ⅱ期临床试验，结果表明，具有一定的预防作用，但临床资料并不能证明其安全性和有效性［29］。由于早期开发的HSV 灭活疫苗免疫原性低、功效差及存在潜在致癌性等缺陷，现已基本停止研究［30］。

2.4 亚单位疫苗 目前研究最多的HSV 疫苗为亚单位疫苗［31］，是通过提取或体外合成HSV 分泌的蛋白以及包膜表面的结构蛋白制成的。已知的HSV上有12 种糖蛋白，研究者多使用gD 和gB 来研制亚单位疫苗，通过大肠埃希菌等原核表达系统或真核表达系统中的杆状病毒载体系统来合成纯化蛋白。KEVIN 等［32］用原核表达系统中的鼠伤寒沙门菌表达出HSV-1 糖蛋白D，动物实验结果表明，该疫苗可对HSV 产生有效的保护作用。AWASTHI 等［33］研发的gD2／gC2／gE2 三价亚单位疫苗可提高ELASA 试验中和抗体的滴度，对豚鼠具有预防作用，对恒河猴具有免疫原性［33-35］。亚单位疫苗中也常用佐剂联合提高疫苗刺激机体免疫应答的水平。COREY 等［36］对531 名感染HSV-2 但HSV-2 血清（-）的性伴侣和1 862名HSV-2高位感染人群进行2次双盲、随机、安慰剂对照的临床试验，试验开始时、第1 个月和第6个月对受试者肌内三角肌进行gD2-gB2-MF59疫苗3次注射，结果显示，该亚单位疫苗在受试者中诱发了高滴度的HSV-2 中和抗体，但该疫苗的总有效率仅有9%。SITA 等［37］开发了Ⅱ型HSV 联合佐剂MPL 和明矾的gD2亚单位疫苗，临床试验表明，仅对HSV（-）的女性提供了明显的保护作用，但对HSV-1血清（+）的女性和男性无明显的保护作用。ONNHEIM 等［38］近期研制了一款靶向gG2 的疫苗，可增强HSV-1、HSV-2的免疫应答，诱导大量的CD4 T细胞。

2.5 基因工程活病毒疫苗 基因工程活病毒疫苗是利用基因工程方法，将HSV 外源基因插入已证明是安全的、能完整复制的病毒或细菌中，如痘苗病毒、腺病毒及相关病毒、水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus，VZV）和鼠伤寒杆菌等。之后在上述病毒或细菌中即可表达出HSV 的相应蛋白，免疫动物后刺激其产生相应的免疫应答。

MCDERMOTT 等［39］利用重组人腺病毒载体AdgB2 验证基因工程活病毒疫苗的免疫效力，接种AdgB2 的小鼠体内可产生针对HSV gB 高滴度的特异性抗体，且注射后无不良反应。试验表明，该人腺病毒载体不会在小鼠体内复制，且单次免疫小鼠即可保护其免受HSV的攻击。MESEDA等［40］用重组牛痘病毒MVA 载体研制了gD2 疫苗，在实验过程中意外发现，如使用gD MVA 载体而不是gD 质粒载体作为启动免疫，获得了更多样化的抗体同型反应，以及更多的抗体和强烈的细胞免疫反应。MACMILLAN等［41］发现，重组霍乱弧菌幽灵（recombinantVibrio choleraeghost，rVCG）可成功增强人体和动物病原体的体液和细胞免疫应答。该疫苗是由表达衣原体MOMP和HSV-2 gD的rVCG组成，在体内，小鼠经免疫后，在血清和阴道分泌物中均有lgA和lgG2a抗体；在体外，小鼠经联合疫苗免疫后，血清和阴道分泌物中均产生对衣原体和HSV-2 抗原分泌的IgA 和IgG2a 抗体，生殖器官可免受高剂量衣原体和HSV-2的攻击［41-42］。最新研究表明，将gD和UL25基因插入重组腺病毒5（adenovirus 5，Ad5）载体中制备的基因工程活病毒疫苗可诱导强烈的CD4 T、CD8 T细胞免疫［43-44］，在小鼠模型中可有效预防生殖器疱疹［45］。

基因工程活病毒疫苗因其高安全性、可构建多价联合疫苗以及可口服等特点备受关注，但由于有外源病毒的存在，可能会刺激机体产生多种抗体，抗体之间的相互作用对人体健康造成的影响目前尚不明确。另外，疫苗载体中HSV蛋白表达水平较低，诱导的抗体滴度较低，因此，后期应更多地关注如何提高基因工程活病毒疫苗中的HSV外源基因水平。

2.6 合成肽疫苗 从亚单位疫苗到合成肽疫苗，研究者在不断将发挥抗原作用、刺激机体产生免疫应答的抗原单位缩短。2008年，一种以HSV-2 gB 中的HLA a *0201 限制性表位非共价链接，与截短的HSP70 佐剂结合的多肽疫苗AG-702 经Ⅰ期临床试验证明安全性良好，但56 名受试者的T 细胞数据显示，并未检测到对HSV-2 CD8+表位增强的免疫应答［19］。一种包含22个HSV-2蛋白与重组人Hsc70蛋白（命名为HerpV，原AG-707）非共价键链接而成的合成肽疫苗［46］已于2006年完成了Ⅰ期临床试验，2015年完成了Ⅱ期临床试验，其安全性高，且具有良好的免疫原性，受试者在注射疫苗前后，CD4 T和CD8 T 细胞应答差异有统计学意义。HerpV 是第一个在HSV 血清阳性受试者中诱发广泛CD4+和CD8+T 细胞免疫应答的候选疫苗［47］。目前，多种生物信息学技术更多地应用于HSV疫苗的开发中。采用DNAstar 序列比对、生物信息学软件系统BioSun和Antheprot 蛋白序列分析相结合的方法，对HSV-2 gB2、gC2、gE2、gG2和gI2的20个候选表位进行预测，并在体外进行生物学功能测试，结果发现，其中17个候选表位在EIA 测试中可与抗血清产生应答，有5个肽段与抗血清的反应较强烈，分别为gB2466-473（EQDRKPRN）、gC2216-223（GRTDRPSA）、gE2483-491（DPPERPDSP）、gG2572-579（EPPDDDDS）和gI2286-295（CRRRYRRPRG），上述5种多肽与BSA载体蛋白结合均可刺激小鼠产生免疫应答［48］。由此可见，合成肽疫苗是具有潜力的候选疫苗之一。但由于其分子量较小，免疫原性常不能达到设计者的预期，保护效力相对较弱，研发时需寻找适应的载体相互结合。

3 局限性与未来方向

目前为止，尚无HSV 疫苗成功上市［3］，提示研究者需制定合理的HSV 疫苗研制策略，所研制的HSV疫苗复制周期应比病毒的复制周期长，具有能被宿主容易识别的靶点，刺激机体迅速产生免疫应答，且具有无嗜神经毒性等特点［49］。针对HSV 疫苗的开发，哈钦森癌症研究中心另辟蹊径，其关注点并不是复制病毒本身、DNA或病毒表面蛋白，而是用经过改造的酶在关键位点的切割，以清除整合性或非复制性的附加型病毒的基因组为目标，结果目前尚无定论，但可作为一个全新的角度来尝试HSV 疫苗的研制，这也提示HSV 疫苗目前未获批上市的原因可能是研制策略需要调整，同是在HSV 疫苗研发过程中可能存在某些局限性。

3.1 寻找培养病毒的合适细胞系 资料表明，人胚肺细胞（MRC-5）和非洲绿猴肾细胞（Vero）多用于HSV的分离培养，其中HSV-1多在Vero细胞或人胚胎肺成纤维样细胞（KMB17）中培养扩增，HSV-2多在Vero 细胞、地鼠肾细胞（BHK）和人喉表皮样癌细胞（Hep-2）中进行培养［50］。据报道，通过空斑数和细胞病变出现的特征与时间对比黑松鸡猴肾细胞（BGM）、宫颈癌细胞（Hela）、人二倍体细胞（HEL）、人非小细胞肺癌细胞（A549）对HSV-1 的敏感程度，进而得到HSV-1 分离培养较为理想的细胞，结果发现，BGM细胞优于其他类别的细胞［50］。但由于病毒或细胞表面蛋白结构的影响，使用细胞培养病毒时，获得的病毒量很少，应进一步探讨使用何种新型细胞系可提高病毒量。

3.2 疫苗试验过程中合理选择实验动物人类感染HSV 后，不会对生命构成威胁，但小鼠感染HSV 后，多会对其产生致命的攻击［51］。因此，用小鼠模型进行HSV疫苗实验存在很多局限性。研究发现，小鼠模型适于开发预防性疫苗，豚鼠模型适于开发治疗性疫苗，但由于豚鼠不适合用基因敲除实验来评估作用机制［52］，人们尝试利用恒河猴等与人类亲缘关系较近的实验动物，尽量缩小动物实验和临床试验的差距，缺点是使用恒河猴来进行模拟实验成本太高［53］，提示急需建立一个更有效的动物实验平台，见表2。

表2 HSV疫苗动物模型Tab.2 Animal models used for HSV vaccines

其次，构建模型时，实验动物的性别也是应考虑的重要因素。临床资料表明，HSV-2 在男性中的发病率明显低于女性，可能与其生殖结构密切相关。男性和女性生殖器部位的免疫细胞和微生物群不同，女性阴道处免疫细胞较多、多为厌氧微生物；而男性免疫细胞少，多为需氧微生物。在以往的研究中发现，研制HSV 疫苗时多用雌性动物［2］，但应用于雄性动物中，疫苗的保护效力低于雌性动物［2］，因此，应充分考虑实验动物的性别差异对HSV 疫苗的限制，进而开发兼容性更高的HSV疫苗。

3.3 合理使用佐剂大量文献表明，疫苗联合佐剂的应用诱导了更有力的T细胞免疫和抗体水平。在疫苗研制过程中，CPG、MPL、MF59、QS21、HSP70和明矾等已被用作HSV疫苗的佐剂。如HSP70能够通过MHCⅠ类途径交叉提呈外源性病毒抗原，与HSV gB498-505表位耦合成重组HSV gB 疫苗，可在生命早期抵抗HSV的攻击［22］，HSV联合佐剂MPL和明矾的gD2亚单位疫苗可对HSV（-）的女性提供明显的保护作用［54］。HSP70联合HSV gB蛋白可将HSV抗原肽呈递至CD8+和CD4+T淋巴细胞，还可激活抗原提呈细胞，并促进机体免疫应答［55］。有文献表明，以细胞因子、趋化因子、免疫刺激调节分子和共刺激分子作为HSV-2 疫苗佐剂的DNA 疫苗可诱导机体产生强烈的免疫应答。SIN 等［56］将编码IL-12 P40 与编码IL-12 的P35质粒与HSV-2 PgD 质粒共同免疫小鼠，结果发现，小鼠体内免疫球蛋白lgA、lgG 水平明显增高。之后用免疫刺激调节分子CD154 作为佐剂共同免疫小鼠，仍可观察到小鼠T细胞免疫应答增强，且面对HSV-2致死剂量攻击时，小鼠死亡率显著降低［56］。SHLAPOBERSKY 等［26］将pDNA 与Vaxfectin（一种基于阳离子脂质的佐剂）开发了gD2 疫苗，用HSV-2 致死剂量攻击小鼠，发现小鼠神经毒性明显减弱，提示VaxfectingD2 pDNA具有作为未来多价HSV-2疫苗联合佐剂的潜力。大多数佐剂可刺激先天免疫细胞或树突状细胞，从而诱导有效且持久的免疫应答。由此可见，佐剂的合理应用可大大提高免疫应答的效率，因此，实验过程中佐剂的选择至关重要，但联合新型佐剂的HSV疫苗对人体产生的副作用应额外关注。

3.4 关注疫苗不同注射方式对其保护作用的影响资料表明，疫苗的接种途径均是具有高度经验性的，通过反复对比不同方式接种疫苗的保护作用，从而选择一种对机体保护作用最高的疫苗接种方式作为标准［4］。但最近一项研究表明，HSV-2候选基因缺陷活病毒疫苗ACAM529［16］，不同注射方式可在小鼠体内产生不同的相对免疫原性和保护效力。通过皮内、皮下和肌内途径注射ACAM529，结果表明肌内注射途径对小鼠的保护作用最强。胡凯等［57］设计了一款以PEI-Fe3O4 为载体的DNA 疫苗pRSC-gD-IL-21，在小鼠HSK动物模型中，通过眼表黏膜注射方式刺激小鼠产生了明显的细胞免疫、体液免疫和特异性黏膜免疫应答。由此可见，疫苗不同的注射方式在疫苗的作用发挥方面起重要作用，对注射方式的考量为进一步的临床试验研究奠定了基础。

随着HSV生物学特点，病毒感染、潜伏和复发机制等的深入研究，相信未来HSV 疫苗的研制将在上述研究的基础上寻找到新的突破点。