牛乳溯源研究进展

孙璐，崔占鸿

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

随着食品贸易的全球化，食品的可追溯性和真实性变得越来越困难。利用分析工具来明确食品及其衍生产品的来源和成分真实性对消费者而言十分重要[1]。确定乳及乳制品地理来源对保护消费者利益至关重要，原产地溯源是根据物质结构中的水平，应用化学、生物分子和同位素方法来获得目标信息[2]。产地溯源技术有很多，包括电子鼻、稳定同位素技术、矿物多元素指纹分析、单核苷酸多态性、高效液体色谱(HPLC)及脂肪酸和氨基酸的碳氮同位素组成等[3]。农产品中的矿物质元素和稳定同位素受加工工艺和贮藏时间影响较小，且相对稳定，可用于确定农产品的地理来源[4]。另外，计算机模式识别分析已成为地理溯源过程中必不可少的工具，通过多个可测量的变量，可以对不同地理来源的食品样品进行分类。模式识别主要包括判别、主成分、因子和聚类等分析。选择分类技术的合适与否，取决于多种因素，包括对标准定义、样本均匀度、输入变量的数量和样本数量等。通常的做法是应用一种以上的分析技术并评估它们对所研究问题的适用性[5]。总之，食品安全和掺假的鉴别成为居民生活中最关注的问题之一，对产品成分和地理来源的确认，对保护生产者和消费者免受欺诈是十分必要的。对能够可靠地表征典型乳制品，并追溯其生产区域分析工具的需求非常突出，可以采用各种现有的分子和计算机技术实现认证的目的。

乳及乳制品被列为均衡健康饮食的重要元素，牛乳为机体提供了必要的能量和营养，确保机体的正常生长和发育，尤其对于骨骼的形成至关重要。在预防心血管疾病、部分癌症、肥胖和糖尿病等多种慢性疾病方面牛乳也具有积极作用。牛乳富含免疫球蛋白、乳铁蛋白、肽类、肌苷酸等多种与机体健康和代谢密切相关的生物活性物质。牛乳中的乳铁蛋白能够抗菌、抗病毒、调节免疫功能、抗肿瘤及降低慢性疾病的风险有关[6]。牛乳是最早进行掺假的产品之一，可以通过在原乳中添加化合物改变其成分，以不同的形式残留在乳中，对消费者的健康造成危害。例如，添加三聚氰胺以增加蛋白含量，乳及其制品中残留的三聚氰胺会影响肾脏，甚至造成机体死亡。乳的营养品质与品种、动物个体代谢水平、季节、健康状况、营养水平和挤奶次数均会导致牛奶代谢物谱的改变。不同的代谢谱将在牛乳指纹鉴别过程中发挥关键的作用，通过指纹分析技术对牛奶质量控制及来源的标记对消费者和乳制品行业都有好处。

1 牛乳营养成分

1.1蛋白质

乳蛋白是人类营养优质蛋白质的重要来源，含量约占牛乳的3%左右，主要由高丰度蛋白和低丰度蛋白构成，其中高丰度蛋白以酪蛋白为主。而低丰度蛋白主要包括乳清蛋白，乳脂肪球膜蛋白及乳铁蛋白等[7]。随着各研究领域的不断深入，大量的牛乳蛋白质已经被确定对健康有很大的益处，例如抗癌蛋白(β-乳球蛋白、乳铁蛋白、α-乳清蛋白)、抗高血压蛋白(α-吗啡样肽、β-吗啡样肽、β-lactosin B 和酪蛋白衍生的乳三肽)；免疫调节蛋白(如乳铁蛋白、乳过氧化物酶、牛奶生长因子、免疫球蛋白G)[8]。另一方面，牛奶蛋白过敏是儿童中一种常见的疾病，属于IgE介导的Ⅰ型过敏反应，可能会引起呼吸道症状、湿疹、荨麻疹或腹泻[9]。儿童作为乳品消费链中的特别关注对象，乳品成分安全及产地来源对其健康而言十分重要。因此，牛乳及其制品的可溯源问题值得重视。

1.2氨基酸

氨基酸作为蛋白质的基本单位，是一类含有氨基和羧基广泛存在于自然界的小分子化合物，可分为非蛋白质氨基酸和蛋白质氨基酸[10]。牛乳蛋白质由血浆中的游离氨基酸、肽、蛋白质和葡萄糖合成，血浆中游离氨基酸谱的改变也会影响牛乳中的游离氨基酸谱，机体内的氨基酸浓度随着泌乳期而逐渐降低[11]。氨基酸与区域之间存在一定的相关性，来自不同地区的牛乳营养成分存在一定差异，如氨基酸和寡肽可作为生物标志物来识别产地名称保护认证的(PDO，Protected Designation of Origin)奶酪和非 PDO 奶酪[12]。氨基酸与蛋白质的追溯分析和肽的定量有关。

1.3脂肪

脂肪是一种营养元素，是人体非常重要的组成部分，大多数脂肪由甘油和脂肪酸构成，粗脂肪还含有磷脂，固醇类(甾醇)等[13]。乳脂的含量和组成主要受奶牛摄入的日粮性质影响，导致牛乳中的脂肪酸谱随饲料的不同而改变[14]。农户可以通过管理奶牛的营养水平来显著改变牛奶的挥发性脂肪酸含量，日粮中的新鲜牧草会提高不饱和脂肪酸，如 α-亚油酸和 CLA)的浓度，降低饱和脂肪酸(SFA)的含量，同时添加干草或青贮饲料会增加牛奶中SFA的比例。此外，与冬季相比，夏季乳脂的总 SFA 浓度通常较低，因为夏季饲料作物的多不饱和脂肪酸含量较高[15]。综上所述，母畜饲料结构组成中某些微量营养素和脂肪酸浓度的改变是改变乳品质的有效手段，也正因如此，越来越多的消费者将动物饮食视为判断产品质量的重要标准。牛乳及其制品中的脂肪酸也可以作为溯源过程中的一个追踪物。

1.4维生素

维生素是机体必需的七大营养素之一，在食物中虽然含量较少，但种类较多，化学结构也不相同。维生素共有13 种营养素，包括4种“脂溶性”和9种“水溶性”，这些维生素对于维持健康的体内平衡和代谢功能都是必不可少的。不同品种和来源的乳及制品中的部分维生素含量存在差异。Rahat Ullah[16]等基于 β-胡萝卜素和维生素A 荧光光谱结合多元技术鉴定了牛奶和水牛奶，有效地测定了牛奶和其他乳制品中的掺杂物。Naveed Ahmad[17]等,通过用荧光光谱法，基于维生素 A、E、K、D 和 CLA 的光谱特征，绘制加载向量得到验证，从而区分鉴定了牛和水牛酥油。

1.5矿物质

矿物质即无机盐，机体无法自己合成，只能通过食物获得[18]。牛乳中的矿物质为有机酸合成的盐，在乳中一般占比约为0.7%[19]。矿物质是维持机体健康的重要组成成分之一，矿物质营养缺乏将会导致儿童生长速度减慢、热量减少、骨质疏松、骨折和骨骼组织发育延迟[20]。牛乳中的矿物质与人体健康而言十分重要，不同地理来源的牛乳矿物质含量存在差异，可作为牛乳地理溯源过程中的一个重要的溯源指标，实现不同地理来源的牛乳溯源。

2 指纹图谱技术

2.1稳定同位素技术

同位素是指具有质子数相同和中子数不同的一类元素的总称,可分为放射性同位素和稳定性同位素[21]。这两种同位素的不同之处在于放射性衰变的能力。在早期，放射性同位素由于易于检测而成为许多生物试验的首选工具，随着高灵敏检测方法的发展以及对使用放射性标记化合物存在的安全隐患考虑，稳定同位素技术的利用逐渐广泛，现在已知的稳定和放射性同位素有 300 多种[22]。在生物学科中常用的稳定同位素为碳 (13C)、氮 (15N)、氧 (18O) 和氢 (2H)，这些同位素根据质量差异使其分析上可以相互区分并通过化学方法引入到脂肪酸、氨基酸和糖类等有机化合物中，从而“追踪”这些化合物的生物代谢过程。当同位素技术分辨率越高，代谢“指纹”就越明显[23]。Rebecca J.McLeod[24]等使用电感耦合等离子体质谱法和同位素比质谱法分析了58个山羊全脂奶粉样品和一套 13 种矿物质元素及同位素δ13C 和 δ15选择 N 以创建化学指纹，使用主成分分析和主坐标的规范分析来评估不同地理来源之间和随时间推移的样品化学指纹的差异。

2.2矿物质指纹分析技术

随着国际市场的发展和对优质农产品的需求，食品的安全性和真实性已成为消费者关注的主要问题。为了保护特定地理区域的优质农产品，建立食品追溯系统非常重要。不同地域来源的牛乳矿物质含量差异明显，矿物质指纹分析技术也因此成为鉴别牛乳地理来源的方法之一。食品产地溯源中利用矿物元素指纹分析技术的主要决定因素是从多种矿物元素中选出能够正确表现与该食品相关且较为稳定的矿物元素指纹的信息[25]。依托判别分析等一些化学计量学法对来自不同地域来源的食品重点矿物质指标的差异进行比较研究，从而明晰不同地区来源产品的差异性指标，并建立判别模型，鉴别未知样品[26]。但是矿物质指纹分析技术也有一定的局限性，动物源性农产品体内的矿物质含量受到饲料、饲喂方式的影响具有一定的不确定性，而且在样品前处理的要求也较高，因此为了提高检测效率应正确选择研究对象[27]。矿物指纹分析已应用于多种农产品及其衍生产品的地理真实性研究，例如蜂蜜、水果、大米、酒和马铃薯[28]。总之，矿物质指纹分析技术是地理来源分类，明确品种、物种和真假的有力工具且作为一种有效的数据分析方法，化学计量学在食品来源和质量的识别中也得到了广泛的推广。

2.3电子鼻

电子鼻是一种检测挥发性有机化合物的新技术，由一系列对化学成分灵敏的传感器组成，是一种模拟人类嗅觉的低成本、快速检测仪器[29,30]。电子鼻可以通过将传入的气味与先前学习的模式进行比较来识别不同的复杂气味从而创造所谓的呼吸印。当挥发性有机化合物在电子鼻传感器的表面发生反应时会出现读数，使传感器的电导率发生变化[31]。虽然电子鼻可以对不同样品气味轮廓的细微差异进行区分，但其无法定性定量分析某一种挥发性成分[32]。随着科技进步已经开发了几种不同的电子鼻，主要是使用不同的传感器，例如微热板金属氧化物传感器、花青素涂覆的金电极石英晶体微量天平传感器、覆盖有金属卟啉的石英晶体微量天平、金属氧化物半导体传感器等[33，34]。目前电子鼻主要是和气相色谱—质谱法 (GC-MS)一起使用，以帮助识别导致呼吸印迹发生变化的特定生物标志物并测试电子鼻检测过程中某些条件的准确性。

2.4色谱技术

气相色谱—质谱 (GC-MS) 结合固相微萃取 (SPME) 是作为最常用的分析工具之一，用于区分来自不同地理来源的饮料和食品，通过识别挥发性物质的细微分析差异指纹过将假定的挥发性有机化合物建立为地理标记[35]。GC-MS 是分析挥发性化合物的最广泛使用的技术之一，因为它在从复杂系统中分离、鉴定和定量单个挥发性化合物方面具有出色的性能。近年来，GC-MS结合主成分分析(PCA)、层次聚类分析(HCA)、相似性分析(SA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等多元分析在代谢组学分析、化学品的分类、质量控制中广泛应用[36]。此外，研究人员还开发了一种新型的红外辅助萃取与顶空固相微萃取 (IRAE-HS-SPME) 和气相色谱—质谱联用 (GC-MS) 相结合的方法，用于快速测定食品中的挥发性成分，如中药真伪检测、蜂蜜掺假、树莓酒特性检测和不同柑橘茶鉴别等[37]。

3 指纹图谱技术在牛乳中的应用

3.1矿物质多元指纹分析技术在牛乳中的应用

为了实施有效的食品安全计划需要追踪食品来源的真实性并防止掺假，越来越多的研究通过使用不同的分析技术致力于根据食物的特征化学成分确定其地理来源。牛乳作为适合各个年龄段食用的食品，其成分安全性和来源于广大消费者而言及其重要。许多研究表明，不同来源的牛乳中的矿物质成分水平存在差异。尽管其中钾、磷、氯、钙和钠等一些矿物质相同，但每种矿物质的含量不同。为了检测乳及乳制品的季节性和地理变化，矿物质和微量元素的成分分析对于乳制品行业很重要。Olafur Reykdal[38]等为了明确冰岛常用食品(全脂牛奶、新鲜奶酪、硬奶酪、羊肉和碎牛肉以及脱脂牛奶、奶油和乳清)的季节和地理变化，利用电感耦合等离子体质谱仪 (ICP-MS) 检测样品中矿物质和微量元素的浓度发现全脂牛奶中的硒的含量发生了变化。高玎玲[39]为了系统全面的检测与评价蒙古乳中矿物质含量，以从内蒙古自东向西9个旗县采集奶牛、山羊、蒙古马和双峰驼四种家畜原奶共79份为检测对象，检测了23种常量和微量元素，利用描述性统计和化学计量学进行了物种和地区矿物质特征分析，并探究了矿物质谱模型进行物种真实性判别及产地溯源的可行性，结果表明四种家畜乳的矿物质含量存在差异，不同地区乳矿物质含量存在差异。相对于常量元素，微量元素地区差异较大，其中硒元素具有明显的丰度效应。环境条件极大地影响着牛乳中的硒含量，这可能主要是因为硒受土壤中元素的含量和有效性影响，不同地区牧草和饲料中硒的含量不同从而使牛奶中的硒含量受饲料中硒含量及其有效性受到影响。

3.2稳定同位素技术在牛乳中的应用

在牛乳和乳制品的掺假食品链透明度、保证食品质量和安全以及确定乳制品真伪方面，稳定同位素技术也是常用的技术之一。牛奶的成分从根本上取决于奶牛的喂养情况，从而取决于特定的环境。然而，稳定的同位素组成在环境中并不总是恒定的，甚至在同一区域也会发生变化。Gregori[40]等使用 IRMS 进行不同来源牛乳中δ2H 和δ18O的稳定性测定，通过方差分析偶发现不同地区、年份和季节的牛乳δ18O值存在显着差异 (P< 0.05)。Andrius[41]等更好地了解水和食物来源对氧、碳和氮稳定同位素比(18O/16O、13C/12C 和15N/14N)分布和一年中不同季节的牛乳中矿物质含量的变化。与区分牛奶的来源相比，脂肪酸的稳定同位素组成也被证明是反刍动物代谢转化过程的更好生物标志物。Doris[42]在2012 年、2013 年和 2014 年，每年冬季和夏季采集四个不同地区的牛乳样品，并对其中的脂肪酸的百分比和稳定同位素比率进行研究，以了解不同季节、年份和区域牛乳的变化，结果显示基于脂肪酸组成的判别分析模型在根据生产年份/季节(86.9%)区分牛奶方面是有效的，地理来源区分不太成功(64.1%)。总而言之，δ18O、δ13C 和δ15N 为牛乳分析提供了有关天然样品中稳定同位素比率变化量的宝贵信息，有助于牛乳及乳制品认证的研究。

3.3电子鼻在牛乳中的应用

电子鼻作为一种低成本和破坏性小的设备，也可以用于识别牛奶来源并估计牛奶质量指标中乳脂和蛋白质含量。Zoltan[43]等依托益生菌与发酵食品中独特的香气化合物的特性，用电子鼻区分不同发酵时间(0d、4d、11d)的细菌菌株。因此，利用电子鼻建立模型，可以快速预测和监测菌株的一些主要微生物特征和发酵过程中产生的主要香气成分。龙鸣[44]等为区分判别牦牛乳的牛种、地区、胎次及真伪，利用电子鼻采集了不同牦牛生乳及不同掺杂物比例牦牛乳的气味信息，并结合多元统计分析，结果显示牦牛乳气味指纹图谱通过PCA与CDA分析可判别区分出不同品质的牦牛乳，尤其对不同胎次牦牛乳的判别区分效果明显优于其他指纹图谱。吴丹丹[45]等为了迅速准确地鉴别掺假骆驼乳的气味特征，通过电子鼻10个传感器和多变量结合分析更快速、准确的评价了不同掺假浓度(0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%和100%)的驼乳。高雅慧[46]等利用Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻对不同加工方式牛奶中的挥发性有机化合物进行检测，并采用主成分分析、样品间区别指数分析和主成分载荷图分析对不同加工方式牛奶挥发性物质的差异性进行比较。总之，电子鼻已成功用于评估牛乳及乳制品保质期预测、牛奶中细菌培养的分类，乳制品地理来源分类，奶酪分类中潜在的工具。

3.4色谱技术在牛乳中的应用

农产品领域是 HPLC-MS 的应用学科和工业中发展最快的领域之一。由于分子特异性和高灵敏度，液相色谱—串联质谱法(HPLC-MS/MS)是目前基于FDA建立的检测牛奶和婴儿配方奶粉中三聚氰胺的方法[47]。P.Gao[48]结合化学计量学的凝胶过滤色谱(GFC)指纹方法进行原料乳的指纹分析。分析了 10 个批次的 120 个原料奶样品，以在最佳条件下建立 GFC 指纹图谱并使用标准色谱指纹图谱和 PCA 检测原料奶中的蛋白质掺假。选取每个原料乳样品色谱图共有的6个主要峰进行指纹图谱分析，利用特征峰建立标准色谱图谱。然后应用主成分分析对掺假乳和生乳的 GFC 信息进行分类，从而在主成分分析得分图中从生乳中有效筛选出掺假样品。指纹法在检测牛奶蛋白掺假方面表现出有前景的特征。Ha-Jung Kim[49]等通过气相色谱分析牛奶和掺假牛奶脂肪混合物(掺假比例为 10%、30%、50%、70% 和 90%)的脂肪酸、三酰甘油和胆固醇特征。结果表明，油酸(C18∶1n9c)和亚油酸(C18∶2n6c)脂肪酸、C52和C54甘油三酯、胆固醇含量与掺假率显著成正比。纯乳脂中的油酸 (C18∶1n9c)、亚油酸 (C18∶2n6c)、C52 和 C54 低于掺假混合物。气相色谱技术用于检测关键脂质(例如，甘油三酯)具有评估牛奶来源和检测牛乳中的添加物。此外，还有一些基于质谱 (MS) 的脂质指纹检测技术无需有机溶剂萃取的新型检测方法。因此，色谱技术是一种灵敏、廉价且快速的方法具有用于牛乳真实性应用的潜力。

4 展望

牛奶在人类饮食中至关重要。对这些液态食品的需求不断增加，使它们在加工和供应链中容易受到产品掺假的影响。掺假品很难被消费者发现，因此需要快速、准确和灵敏高的检测方法。本文已经描述了各种技术的潜在优势和局限性。此外，光谱技术与化学计量学相结合，也是有快速、精确和灵敏地检测这些液体食品中潜在掺杂物的潜力。