嘧菌酯对河南省小麦茎基腐病菌的抑制活性及对病害的防治效果

郭雨薇, 徐建强, 亢豪佳, 殷消茹, 刘圣明, 陈根强

(河南科技大学 园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471003)

小麦茎基腐病是由多种镰刀菌引起的土传病害，其中主要病原物为假禾谷镰孢Fusarium pseudograminearum[1-2]。自2012 年河南省首次报道由假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病后[3]，该病就在中国东部小麦主产区普遍发生，且危害日趋严重[4-5]。2021 年2 月，该病已被列入《河南省二类农作物病虫害名录》[6]。目前，小麦茎基腐病的防治主要以化学防治为主，但还未有防治小麦茎基腐病的药剂登记。嘧菌酯(azoxystrobin)为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(methoxy-acrylates)，属于呼吸抑制剂C3 类[7]，作用靶标为真菌线粒体复合物Ⅲ，即线粒体内膜外壁上细胞色素bc1 复合物上的醌氧化位点(ubiquinol oxidationsite)——Qo，与Qo 位点的细胞色素b 低势能血红素(Qo-proximal)结合，阻止电子从细胞色素b 向c1 的转移，破坏ATP 合成，干扰真菌进行呼吸作用，故又被称为Qo 位点抑制剂(QoIs)[8-9]。嘧菌酯不仅具有广谱杀菌性，对植物还兼有保护和治疗的效果[10-11]。根据FRAC (Fungicide Resistance Action Committee)报告，目前尚未有镰刀菌对QoIs 类药剂产生抗药性[12]。因此评价小麦茎基腐病对嘧菌酯的敏感性，并通过离体接种和温室盆栽试验评价嘧菌酯的防治效果，可为该药剂在小麦茎基腐病综合防治中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、药剂及培养基

1.1.1 试验菌株 2021 年在河南17 个县市采集有典型发病症状的小麦茎基腐病标本，即近地面茎节处有粉红色霉层，将发病茎节剪下，经分离纯化获得小麦茎基腐病菌，转接在马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)斜面上，4 ℃冰箱保存。对获得的菌株利用假禾谷镰孢(Fpg-F, 5′-CGGGGTAGTT TCACATTTCCG-3′/Fpg-R, 5′-GAGAATGTG ATGACGACAATA-3′; 扩增长度 520 bp)和禾谷镰孢(Fg-F, 5′-TTCTTTGACATCTGTTCAACC CA-3′/Fg-R, 5′-ACAGATGACAAGATTCAGGCA CA-3′, 扩增长度280 bp) 特异性引物进行分子鉴定，获得假禾谷镰孢76 株，禾谷镰孢6 株，共82 株。

表1 试验所用药剂信息Table 1 Information of tested fungicides in the study

1.1.3 供试培养基 马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂16 g，加去离子水至1 L，用于菌株分离、纯化、保存；绿豆汤培养液：绿豆30 g，煮沸至绿豆裂开，加去离子水定容至1 L，过滤去除绿豆，用于菌株摇培产孢；水琼脂培养基：琼脂16 g，去离子水定容至1 L，用于孢子萌发的测定；小米培养基：30 g小米煮熟晾干，装入锥形瓶中灭菌备用，用于温室防效的测定[13]。

1.2 嘧菌酯对小麦茎基腐病菌的抑制作用

1.2.1 嘧菌酯对假禾谷镰孢及禾谷镰孢孢子萌发的抑制活性测定 采用孢子萌发法[13]。供试菌株培养3 d 后，在菌落边缘打取8 个直径为5 mm 的菌饼，放入50 mL 绿豆汤培养液中，在25 ℃、175 r/min 的恒温振荡摇床上进行摇培产孢。培养条件为12 h 光照，12 h 黑暗。摇培5 d 后，用纱布过滤至离心管中，于4 ℃、6 000 r/min 下离心10 min，倒掉上清液，加入清水，反复离心两次。调整孢子浓度为1 × 105个/mL。配制嘧菌酯最终浓度为0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 和1 μg/mL 的含药PSA 平板，并在每个平板内加入100 μg/mL 的水杨肟酸以抑制旁路氧化途径。吸取50 μL 孢子悬浮液均匀涂布在培养基表面，于25 ℃下黑暗培养4 h，以孢子芽管长度大于短半径为萌发，当空白对照萌发率达95%以上时统计各处理孢子萌发情况。每处理重复3 次，每个重复统计100 个孢子。按公式(1)计算各药剂浓度处理下孢子萌发抑制率(Ig)；用WPS 11.1 和DPS V9.50 计算药剂抑制孢子萌发的毒力回归方程和EC50值。

式中：Rc为对照组孢子萌发率，%；Rt为处理组孢子萌发率，%。

1.2.2 假禾谷镰孢孢子萌发对嘧菌酯的敏感性基线建立 将嘧菌酯对76 株假禾谷镰孢孢子萌发的毒力(EC50值)从低到高分为6 个区间，从最小值开始，统计EC50值在每个区间的菌株数和频率。以每个区间的EC50平均值为横坐标，菌株的分布频率为纵坐标，绘制假禾谷镰孢对嘧菌酯敏感性频率分布图。用WPS 11.1 计算测定的EC50值中是否有异常值，按公式 (2) 计算误差值 (M)；当M＞3 时表示该菌株EC50值异常，舍弃[14]。以嘧菌酯对正常菌株的平均EC50值作为病菌对嘧菌酯的敏感性基线。

式中，A代表计算值的绝对值；X代表某一菌株的EC50值；AT代表76 个菌株的平均EC50值；SDT代表76 个菌株EC50值的标准差。

1.2.3 河南省不同地市菌株孢子萌发对嘧菌酯的敏感性差异分析 利用 DPS V9.50 的最小显著差数(LSD)法进行不同地市菌株对药剂的敏感性方差分析。将嘧菌酯对76 株假禾谷镰孢的EC50平均值设为1，将各地区菌株的平均EC50值与之比较，按公式 (3) 计算敏感性指数 (FS)：当FS＞ 1时说明该地区菌株对药剂敏感性低于河南省平均水平，越大，越不敏感；当FS= 1 时说明该地区菌株对药剂敏感性居于河南省平均水平；当FS＜1 时说明该地区菌株对药剂敏感性高于河南省平均水平，越小，越敏感[13]。

式中，AC为各地区菌株平均EC50值；AT为76 个菌株平均EC50值。

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1.2.4 假禾谷镰孢孢子萌发对不同药剂敏感性的比较 为检测嘧菌酯与丙硫菌唑、多菌灵、咯菌腈、氰烯菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯对病菌毒力的敏感性，从76 株假禾谷镰孢菌株中选取67 株，根据对孢子萌发的抑制效果来确定供试杀菌剂对假禾谷镰孢的毒力，并对其进行敏感性比较。

1.2.5 假禾谷镰孢及禾谷镰孢菌丝生长对嘧菌酯的敏感性性测定 采用菌丝生长速率法[13]测定6 株禾谷镰孢及随机挑选的6 株假禾谷镰孢 (PDSYX-2、SQYC-6、LHLY-4、XXWH-2、LYYS-3、XCJA-8) 菌丝生长对嘧菌酯的敏感性。供试菌株培养3 d 后，在菌落边缘打取直径为5 mm 的菌饼，转入分别含1、2、4、8、16 和32 μg/mL 嘧菌酯的PSA 平板上，每平板加入100 μg/mL 水杨肟酸以抑制旁路氧化途径。每个浓度重复3 次，以不含药剂的平板为对照。待对照菌落直径长至80 mm 时，采用十字交叉法测定各药剂浓度下的菌落直径，并计算抑制率，利用WPS 11.1 和DPS V9.50 计算药剂抑制菌丝生长的毒力回归方程及EC50值。

1.3 嘧菌酯对小麦茎基腐病的防治效果

供试小麦品种为百农4 199，供试药剂为15%嘧菌酯悬浮种衣剂。

1.3.1 嘧菌酯对小麦茎基腐病的离体防效 经过预试验筛选出致病力较强的LYXA-8 菌株，制成浓度为1 × 105个/mL 的孢子悬浮液。根据药剂指导用量设计试验，共设5 个处理，T1：15%嘧菌酯悬浮种衣剂180 g/(100 kg 种子)；T2：15%嘧菌酯悬浮种衣剂220 g/(100 kg 种子)；T3：15%嘧菌酯悬浮种衣剂260 g/(100 kg 种子)；CK0：空白对照(清水)；CK：发病对照(接种病原菌孢子悬浮液)。称取5 份各2 g 小麦种子，先用70%乙醇消毒1 min，再用无菌水反复冲洗3 次，在滤纸上晾干。取3 份小麦以稀释至不同浓度的15%嘧菌酯悬浮种衣剂拌种，并在滤纸上晾干，另两份小麦不进行拌种，作为清水对照及发病对照。

采用胚芽鞘接种法[15]，将种子腹沟向下摆入铺有无菌湿润滤纸的玻璃培养皿中，于25 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗条件下培养3 d，其间如有发霉种子及时取出，待胚芽鞘长出2～3 cm、幼叶还未长出时，剪去胚芽鞘的叶尖，在伤口处接种3 μL 孢子悬浮液。培养7 d 后，统计小麦病情指数。每个处理3 个重复，试验重复2 次。病情分级按Li 等[16]的方法；按公式 (4) 和 (5) 计算病情指数(DI)和防治效果(P)。

(4)式中：Ni为各级病株数；i为相应的级数值；Nt为调查总株数。

(5)式中：DICK为空白对照病情指数；DIPT为处理病情指数。

1.3.2 嘧菌酯对小麦茎基腐病的温室防效 采用小米扩繁法[17]并加以改良。经过预试验筛选出致病力较强的LYXA-8 菌株，在PDA 平板上活化，5 d 后在菌落边缘打取直径为5 mm 的 菌饼，每瓶小米培养基内放置7 块，于25 ℃黑暗条件下培养5～7 d，制成小米培养物备用。根据药剂指导用量设计试验，共设5 个处理，同1.3.1 节。

采用温室盆栽试验，将小米培养物与无菌土搅拌均匀(小米培养物与无菌土质量比为0.75：100)，取200 g 装入花盆中，将种子腹沟向下摆在盆内，每盆7 粒，均匀覆盖30 g 带病土壤，于25 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗条件下培养21 d 后取出，用清水洗净根部，放在滤纸上晾干后计算小麦病情指数。每处理重复3 次，试验重复2 次。病情分级、病情指数、防治效果及计算公式参考1.3.1 节。

2 结果与分析

2.1 河南省假禾谷镰孢孢子萌发对嘧菌酯的敏感性及敏感性基线

测定了2021 年从河南省各地采集分离到的76 株假禾谷镰孢对嘧菌酯的敏感性。结果表明：嘧菌酯对76 株假禾谷镰孢的EC50值分布范围在0.02～1.54 μg/mL 之间，呈连续性分布，最大值是最小值的77 倍，平均EC50值为(0.33 ± 0.29) μg/mL(图1)，敏感性曲线呈单峰曲线分布。经数据异常值检验，LHWY-6 的EC50值1.54 μg/mL 和SQYC-6 的EC50值1.23 μg/mL，M值分别为4.17 和3.10，均大于3，视为异常菌株，其余菌株的M值均在3 以下。嘧菌酯对74 株 (97.37%) 正常菌株的平均EC50值(0.30 ± 0.24) μg/mL 可作为假禾谷镰孢对嘧菌酯的敏感性基线。

图1 假禾谷镰孢对嘧菌酯的敏感性(A)和分布频率(B)Fig.1 Determination (A) and distribution frequency (B) of the sensitivity of F. pseudograminearum to azoxystrobin

2.2 河南省不同地区假禾谷镰孢孢子萌发对嘧菌酯的敏感性

通过对EC50值的地理区域分析，同一地区的假禾谷镰孢对嘧菌酯的敏感性差异较大，其中许昌市的菌株间敏感性差异最大，EC50值差异倍数高达32.50 倍，其次为焦作市，差异倍数为26.00，洛阳和商丘2 市的菌株，差异倍数都在20 倍以上；南阳、三门峡和开封3 地的差异倍数均在2.00 以下，分别为1.26、1.35 和1.92；其他地市差异倍数均在2.70～26.00 之间。将嘧菌酯对76 株假禾谷镰孢的平均EC50值0.33 μg/mL 设为1，将各地区菌株的均值与之比较，则安阳、濮阳、开封、平顶山、驻马店和郑州菌株的敏感性均低于河南省平均水平，漯河和商丘菌株的敏感性均高于河南省平均水平，其余菌株均接近河南省平均水平(表2)。

2.3 假禾谷镰孢孢子萌发对6 种杀菌剂与对嘧菌酯敏感性的比较

本研究测定了假禾谷镰孢孢子萌发对丙硫菌唑、多菌灵、咯菌腈、氰烯菌酯、吡唑醚菌酯和戊唑醇的敏感性，分别获得了14、15、5、10、50和27 条毒力回归方程。6 种杀菌剂对假禾谷镰孢孢子萌发的毒力从大到小依次为吡唑醚菌酯 ＞ 咯菌腈 ＞ 丙硫菌唑 ＞ 多菌灵 ＞ 氰烯菌酯 ＞ 戊唑醇，其平均EC50值分别为(0.07 ± 0.04)、(5.42 ±4.78)、(10.81 ± 5.45)、(11.33 ± 10.96)、(12.85 ±12.19)和(132.62 ± 78.58) μg/mL (图2)，分别是嘧菌酯平均EC50值的0.21、16.42、32.76、34.33、38.94 和401.88 倍。除吡唑醚菌酯对孢子萌发的毒力较嘧菌酯强外，其余5 种药剂对孢子萌发的抑制作用均弱于嘧菌酯。

图2 假禾谷镰孢对7 种杀菌剂的敏感性Fig.2 Sensitivity of F. pseudograminearum to 7 fungicides

2.4 禾谷镰孢孢子萌发对嘧菌酯的敏感性

本研究从河南省驻马店确山、汝南和信阳息县共分离鉴定了6 株禾谷镰孢。嘧菌酯对这6 株禾谷镰孢的EC50值在0.10～0.42 μg/mL 之间，最大值是最小值的42 倍，平均EC50值为(0.19 ±0.12) μg/mL。

2.5 假禾谷镰孢和禾谷镰孢菌丝生长对嘧菌酯的敏感性

嘧菌酯对6 株假禾谷镰孢菌丝生长的EC50值为10.76～74.10 μg/mL，对6 株禾谷镰孢菌丝生长的EC50值为7.16～19.13 μg/mL。嘧菌酯对这两种镰孢菌丝生长的EC50值均大于7 μg/mL，说明两种镰孢菌丝生长对嘧菌酯的敏感性均较弱。

2.6 嘧菌酯对小麦茎基腐病的防治效果

离体条件下，嘧菌酯对小麦茎基腐病的防效随着施用剂量的增加而增加：尽管低浓度时有一定防效，但病情指数与对照相比没有显著差异；当剂量达到260 g/(100 kg 种子)时，病情指数显著降低，防治效果最高 (表3)。

温室试验中，嘧菌酯各处理的病情指数均低于对照，其中施用剂量为220 g/(100 kg 种子)时达显著水平；低浓度时对病害的防治效果不明显，但防效并未随着药剂施用剂量的增加而变大，其中220 和260 g/(100 kg 种子)剂量下的防效接近，均在50%左右，220 g/(100 kg 种子)剂量下的防效最高(表3)。

表3 嘧菌酯对小麦茎基腐病的防治效果Table 3 Control efficacy of azoxystrobin against wheat crown rot in vitro and in greenhouse

3 讨论与结论

小麦茎基腐病近年来已在河南各地被发现，其中河南北部地区多为假禾谷镰孢[18]，这些区域多为温暖干旱的气候，这与美国小麦茎基腐的分布规律相似[19]。随着近些年来保护性耕作政策的实施，秸秆大量还田，导致土壤中病原菌含量提高，小麦茎基腐病等土传病害发生日趋严重，从而影响小麦产量[20-21]。本研究中的小麦茎基腐病病原菌为禾谷镰孢和假禾谷镰孢，这两种病原菌均产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素(DON)，此种真菌毒素可污染小麦籽粒，一旦被人畜误食，很容易引起中毒[22-23]。本研究所建立的假禾谷镰孢对嘧菌酯的敏感性基线约为已报导的假禾谷镰孢对醚菌酯敏感性基线的20 倍[13]。究其原因：一方面是由于药剂活性不同造成的，另一方面也可能是由于测试菌株数的差异造成。本研究所用菌株为2021年采自河南省17 个县市的76 株，而王莉莉等[13]测定假禾谷镰孢对醚菌酯敏感性时所用菌株为2019年采自河南省的13 个县市的50 个菌株。通常不同病原菌对杀菌剂的敏感性具有地理时空尺度差异性[24]，本研究结论证实了此观点。

嘧菌酯尚未登记用于小麦茎基腐病防治，本研究中仅有2 株 (2.63%) 菌株在数据异常值分析中显示异常，这是否是由于地理差异或天然耐药个体的存在所导致，还需要进一步的研究。嘧菌酯作为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有杀菌谱广的特点，对3 种主要的植物病原真菌(子囊菌、担子菌和卵菌)都具有抑菌活性，因此通过建立敏感性基线，从而监测其敏感性变化具有重要意义。根据FRAC 的报道，嘧菌酯在真菌物种中已发生抗药性，其抗性的发生与cyt b的点突变(G143A、F129L)有关，其他机制也可能参与抗药性；而且嘧菌酯产生抗性后与其他QoIs 类药剂有交互抗性[7]，因此生产中应用嘧菌酯防治小麦茎基腐病时，除了定期进行敏感性监测，了解病菌敏感性的变化动态外，还应尽量选用复配剂或与其他药剂轮换应用，以延缓病菌抗药性的发展。

小麦茎基腐病现已在黄海华麦区普遍发生。本研究仅测定了河南省假禾谷镰孢对嘧菌酯的敏感性，而没有涉及河北、山东、安徽等省份的菌株。本研究所建立的敏感性基线，对其他省份菌株是否适用，尚需做进一步的研究。

本研究使用15%嘧菌酯悬浮种衣剂测定对小麦茎基腐病的离体和温室防效，在嘧菌酯浓度为220 g/ (100 kg 种子) 时达到了49%以上的防治效果。在生产中应用时，为了防治苗期病害可使用悬浮种衣剂。由于悬浮种衣剂持效期短，随时间推移防效下降，可在小麦返青拔节期再喷施一次嘧菌酯悬浮剂，以增强对病害的持续控制。