土家族药物豆板还阳的HPLC指纹图谱研究*

张万涛，李鸿，张钰，郑露，涂星

1恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000；2湖北民族大学医学部；3风湿病发生与干预湖北省重点实验室；4湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心

豆板还阳又称石豇豆、岩泽兰、石泽兰、岩豇豆、岩石茶等，为土家族“七十二还阳”药材之一，为苦苣苔科吊石苣苔属植物吊石苣苔（Lysionotus pauciflorusMaxim）的地上部分，具有清肺化饮、凉血止血、利湿通络、调经活血的功效，用于治疗咳嗽、支气管炎、风湿性关节炎、跌打损伤、月经不调、痢疾、钩端螺旋体、烫伤、疳积等［1-3］。现代研究表明，吊石苣苔中主要含有黄酮类、挥发油类、植物甾醇和三萜皂苷类、苯丙素苷类等多种成分，以“石吊兰”项被2015年版《中华人民共和国药典》第一部收载［4-7］。HPLC指纹图谱属于中药色谱指纹图谱技术，它运用现代分析检测技术，考察中药材产地、采收季节、采收部位、炮制加工等信息，在中药质量控制与真伪优劣评价方面发挥着重要的作用［8］。目前，有文献对贵州石吊兰的指纹图谱特征进行了研究和分析，但关于湖北恩施的豆板还阳的相关文献报道较少。本研究拟对恩施8批不同产地的豆板还阳进行HPLC指纹图谱分析并进行相似度比较，为豆板还阳的真伪鉴别和质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 试药与试剂石吊兰药材采集于恩施不同地区，采集方式均为野外采集，经湖北民族大学医学部朱敏英副教授鉴定为苦苣苔科植物豆板还阳（Lysionotus pauciflorusMaxim.）的干燥地上部分，来源信息见表1。石吊兰素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111555-200602，纯度：98.1%，HPLC级）；阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614，纯度：99.0%，HPLC级）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100081-201610，纯度：99.1%，HPLC级）；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为去离子超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 豆板还阳样品来源信息

1.2 实验仪器LC-2030C液相色谱仪（日本岛津，PDA检测器）；VS-100UE型恒温超声提取仪（无锡沃信仪器制造有限公司）；BT-25S型电子分析天平（德国赛多利斯，d=0.01 mg；BSA224S-CW型，d=0.1 mg）；MilliQ超纯水系统（贝徕美生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备精密称取P2O5中干燥至恒重的石吊兰素对照品约10 mg，加甲醇制成100 μg/mL的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备取本品中粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率240 W，频率45 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件Inertsustain C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），检测波长为332 nm，柱温30℃，乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）为流动相，梯度洗脱：0～25 min，15% A；25～55 min，15%→52%A，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。

2.4 精密度试验取石吊兰素对照品（36.76 μg/mL）溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以峰面积计算精密度RSD为0.15%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验取鹤峰县走马镇样品，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，照“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以石吊兰素（tR约为52.3 min，分离度R＞1.5）的色谱峰作为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.37%（n=6），相对峰面积的RSD为0.12%～2.97%（n=6），表明该方法的重复性好。

2.6 稳定性试验取鹤峰县走马镇样品，按“2.2”项下制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以石吊兰素（tR约为52.4 min，分离度R＞1.5）的色谱峰作为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.50%（n=6），相对峰面积的RSD为0.18%～2.91%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 指纹图谱分析及相似度评价

2.7.1 参比峰的标定分别取不同产地豆板还阳样品S1～S8，按“2.2”项下制备供试品溶液，照“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。获得湖北恩施不同产地的土家族药物豆板还阳HPLC指纹图谱叠加图，见图1，共有模式图见图2。从共有模式图可知，8个不同地区的样品中有16个共有峰，经与对照品相比较并结合对照品的保留时间，标定了16号峰为石吊兰素（tR约为52.4 min），16号的色谱峰分离度好、峰面积较大、稳定性好、为所有样品共有且石吊兰素为豆板还阳的主要成分，因此将石吊兰素峰作为参比峰。

图1 8批豆板还阳HPLC指纹图谱叠加图

图2 豆板还阳的共有模式图

2.7.2 相似度评价将样品S1～S8的HPLC指纹图谱测定数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）》软件中，以样品宣恩县七姊妹山（S2）的图谱为参照图谱，得出豆板还阳样品的共有模式图谱，进行相似度评价，结果见表2。

表2 8批豆板还阳样品相似度分析的结果

2.7.3 共有峰的相对保留时间、相对峰面积采用相对保留时间标定共有峰，即将16号峰作为参比峰，计算8批不同产地豆板还阳样品共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果见表3—4。

表3 8批豆板还阳样品共有峰的相对保留时间

表4 8批豆板还阳样品共有峰的相对峰面积

3 讨论

本研究所用的PDA检测器可实现多波长同步分析，经等高线图与光谱图分析后得出，在此色谱条件下，石吊兰素最大吸收波长为332 nm。

本研究选择乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱，在本研究的色谱条件下各色谱法分离度欠佳、色谱峰拖尾且分析时间较长。因此将原来的0.05%磷酸水提高到0.1%，比较了0～20 min，10%→20%A、20～30 min，20%A、30～80 min，20%→48%A；0～15 min，10%→18%A、15～30 min，18%A、30～80 min，18%→50%A；0～15 min，10%→16%A、15～30 min，16%A、30～80 min，16%→48%A；0～25 min，15%A、25～55 min，15%→52%A等梯度洗脱方法。结果发现在梯度洗脱方法：0～25 min，15%A、25～55 min，15%→52%A下，各色谱峰分离度、峰型较好，分析时长较短，故选择该方法用于本研究。

在研究中还尝试用阿魏酸、槲皮素对照品的保留时间定位8个样品中的这两个成分，经比较得出样品中含阿魏酸的地区是：宣恩县长潭河乡（S1）、宣恩县七姊妹山（S2）、咸丰县高乐山镇（S4）、宣恩县高罗镇（S7）、鹤峰县走马镇（S8）；含有槲皮素的地区是：咸丰县高乐山镇（S4）、建始县花坪乡（S6）、宣恩县高罗镇（S7）、鹤峰县走马镇（S8）。造成这些地区化学成分的差异因素，还有待今后进一步研究论证。

恩施各地区的豆板还阳总体药材质量差异较大，且与海拔、经纬度关系不大，推测其化学成分的含量可能与生长环境和样品的采集时间关系较为密切。因此，固定产地，建立豆板还阳的良好农业规范（good agricultural practices，GAP）药材基地，对提高豆板还阳化学成分的含量、保障其质量的稳定性较为关键。

结合图1—2结果，各色谱峰分离较好，各成分基本相同，建立的方法具有良好的精密度、稳定性、重复性，为以后豆板还阳的真伪鉴别、资源开发利用和质量控制提供参考。