木丹颗粒通过miR-146a调控对糖尿病周围神经病变大鼠TLR4通路的影响*

姚伟洁，赵香妍

1首都医科大学附属北京妇产医院北京妇幼保健院，北京 100006；2北京市和平里医院

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）作为糖尿病的常见并发症之一，在病程后期易导致患者肢端溃烂甚至造成截肢，严重影响患者的生活质量［1］。DPN的发病机制复杂，至今尚未完全阐明，有研究发现，炎症反应参与了DPN的发生发展［2］。木丹颗粒作为临床治疗DPN的常用中药，治疗效果显著［3-4］。前期研究发现，木丹颗粒治疗DPN的机制与抑制Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）相关通路，从而抑制炎症反应有关，然而木丹颗粒是通过何种途径调控TLR4通路的至今尚未有深入研究。

相关研究发现miR-146a参与了DPN的发生，并与炎症反应密切相关［5］。但是木丹颗粒能否通过影响miR-146a的表达，调控TLR4通路改善DPN，至今尚未有研究。本实验以木丹颗粒为治疗药物，以链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的DPN大鼠和高糖环境下培养的雪旺细胞（schwann cells，SCs）为研究对象，将miR-146a作为切入点，探讨木丹颗粒调控TLR4通路的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只SD雄性大鼠，SPF级，周龄6～8周，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证编号：SCXK（京）2016-0006。饲养条件：动物饲养于SPF级饲养室，12 h/12 h昼夜交替、温度（23±2）℃、湿度（55±10）%，自由进食饮水。

1.2 实验细胞雪旺细胞选择大鼠RSC96细胞株（American type culture collection），选用dmem（dulbecco's modified eagle medium）完全培养基（培养基中含有4 mM谷氨酰胺，25 mM葡萄糖，1 mM丙酮酸钠，1500 mg/L碳酸氢钠，10% FBS及1%青链霉素混合液）培养细胞，培养环境为37℃和5%CO2的培养箱中。

1.3 药品及试剂链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma-Aldrich，批号：S0130）；α-硫辛酸（Puritan's Pride，批号：6007）；木丹颗粒（辽宁奥达制药有限公司，国药准字Z20080033，规格：7 g/袋）；D-葡萄糖（Sigma，批号：D7021）；澳洲胎牛血清（Gibco，批号：10099-141）；Trizol试剂（Invitrogen，批号：15596-025）；TransStart Tip Green qPCR SuperMix，TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（全式金，批号：AQ141-02、AT301-03）；小鼠单克隆β-actin抗体，兔单克隆TRAF6抗体，兔多克隆IRAK1抗体（Abcam，批号：ab8226、ab33915、ab238）

1.4 实验仪器CareSens血糖仪（i-SENS）；3K15型低温离心机（Sigma）；全波长酶标仪（Molecular Devices，SpectraMax Plus 384）；CFX96TM型实时荧光定量PCR仪（Bio-Rid）；PowerPac™型基础电泳仪电源（Bio-Rid）；Mini-PROTEAN® Tetra电泳槽（Bio-Rid）；小型Trans-Blot®转印槽（Bio-Rid）；371型二氧化碳培养箱（Thermo）；MLS-3020型高压灭菌器（SANYO）。

1.5 动物实验

1.5.1 造模与分组将SD大鼠40只适应性饲养1周后，随机分为2组，设10只为空白对照组，其余30只大鼠腹腔注射60 mg/kg的STZ溶液诱导糖尿病模型，稳定1周后空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）≥16.7 mmol/L的大鼠表明糖尿病模型建立成功。将模型大鼠随机分为模型组、α-硫辛酸组和木丹颗粒组，每组10只。

1.5.2 给药方法α-硫辛酸组给予20 mg/（kg·d）的α-硫辛酸溶液，木丹颗粒组给予2.3 g/（kg·d）的木丹颗粒溶液，空白对照组和模型组给予10 mL/（kg·d）剂量的饮用水，连续给药12周。末次给药1 h后处死大鼠，收集坐骨神经。

1.6 细胞实验

1.6.1 含药血清制备另选SD大鼠30只适应性饲养1周后，随机分为3组，空白血清组15只，α-硫辛酸含药血清组5只，木丹颗粒含药血清组10只。连续干预7天，末次干预1 h后腹主动脉取血，离心半径13.5 cm，3000 r/min离心10 min，4℃分离血清，60℃水浴灭活后除菌（0.22 μm微孔滤膜过滤除菌），分装后用于后续实验。

1.6.2 细胞处理RSC96细胞以4×105细胞/孔的数量接种于6孔板中，将细胞于培养箱中放置过夜，待细胞贴壁后，分别使用空白组大鼠血清、150 mM葡萄糖（Sigma）+空白组大鼠血清、150 mM葡萄糖+10% α-硫辛酸（ALA）含药血清和150 mM葡萄糖+不同浓度（10%、1%和0.1%）木丹颗粒含药血清孵育细胞48 h。

1.7 观察指标

1.7.1 RT-PCR法测定基因表达使用Trizol法分别提取大鼠坐骨神经和RSC96细胞中的总RNA，参照反转录试剂盒说明书，将RNA反转录为cDNA，继续使用SYBR预混系统和特异性引物将cDNA进行RT-PCR扩增，确定每个基因的mRNA表达水平。每个样本设置3个平行复孔，以β-actin作为内参，对各样本miR146、TRAF6和IRAK1进行相对表达量分析，计算2-△△Ct目的基因相对表达量，结果以倍数形式表示。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.7.2 Western blot法测定蛋白表达使用RIPA裂解液分别提取坐骨神经和RSC96细胞中总蛋白，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。在SDS-PAGE凝胶中使用电泳分离蛋白质，并通过湿式转移系统（Bio-Rad，USA）将蛋白转运至0.45 μm PVDF膜上。使用脱脂奶粉室温封闭蛋白2 h后，加入相应一抗4℃孵育过夜。然后加入相应二抗，室温孵育1 h后，加入电化学发光（ECL）试剂并在凝胶成像系统（Bio-Rid）中形成图像。使用Image J软件计算样品灰度值，计算蛋白表达，将β-actin作为内标蛋白，结果以倍数的形式表示。使用了以下一抗：兔单克隆TRAF6抗体，兔多克隆IRAK1抗体，小鼠单克隆β-actin抗体。

1.8 统计学方法使用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料采用±s表示，多组独立样本比较使用One-Way ANOVA，非正态分布数据使用非参数检验方法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠坐骨神经miR-146a、IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表达与空白对照组比较，模型组miR-146a表达显著降低（P＜0.01），IRAK1、TRAF6蛋白和mRNA表达均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，木丹颗粒组miR-146a表达显著升高（P＜0.01），IRAK1、TRAF6蛋白和mRNA表达均显著降低（P＜0.01）。见图1、表2。

图1 各组大鼠坐骨神经IRAK1和TRAF6蛋白表达电泳图

表2 各组大鼠坐骨神经miR-146a，IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表达比较（±s）

表2 各组大鼠坐骨神经miR-146a，IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表达比较（±s）

注：与空白对照组比较，*表示P＜0.01，#表示P＜0.05；与模型组比较，△表示P＜0.01

组别空白对照组模型组α-硫辛酸组木丹颗粒组鼠数10 10 10 10 miR-146a 1.00±0.06 0.35±0.05*0.82±0.05#0.80±0.04#△IRAK1 mRNA 1.00±0.09 1.77±0.08*1.36±0.06*△1.35±0.05*△TRAF6 mRNA 1.00±0.06 1.72±0.03*1.34±0.06*△1.44±0.08*△IRAK1 1.00±0.07 2.20±0.17*1.42±0.05*△1.38±0.04#△TRAF6 1.00±0.10 1.57±0.09*1.27±0.08*△1.23±0.08*△

2.2 高糖环境下雪旺细胞miR-146a、IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA表达与25 mM组比较，150 mM组miR-146a表达显著降低（P＜0.01），IRAK1、TRAF6 mRNA及蛋白表达均显著升高（P＜0.01）；与150 mM组比较，木丹颗粒含药血清组miR-146a表达显著升高（P＜0.01），10%和1%木丹颗粒含药血清组IRAK1和TRAF6mRNA及蛋白表达均显著降低（P＜0.05），0.1%木丹颗粒含药血清组IRAK1 mRNA表达显著降低（P＜0.05）。见图2、表3。

表3 各组含药血清对高糖环境下雪旺细胞miR-146a、TRAF6、IRAK1蛋白及mRNA表达比较（±s）

表3 各组含药血清对高糖环境下雪旺细胞miR-146a、TRAF6、IRAK1蛋白及mRNA表达比较（±s）

注：与25 mM组相比，*表示P＜0.01，#表示P＜0.05；与150 mM组相比，△表示P＜0.01，&表示P＜0.05

组别25 mM组150 mM组150 mM+10%ALA组150 mM+10%MD组150 mM+1%MD组150 mM+0.1%MD组样本量4 4 4 4 4 4 miR-146a 1.00±0.07 0.37±0.04*0.79±0.05*△0.82±0.05#△0.66±0.06*△0.59±0.04*△IRAK1 mRNA 1.00±0.11 1.80±0.05*1.24±0.08#△1.41±0.06*△1.50±0.04*△1.64±0.04*&TRAF6 mRNA 1.00±0.06 1.75±0.10*1.26±0.06#△1.28±0.08*△1.50±0.03*&1.63±0.07*IRAK1 1.00±0.09 2.52±0.20*1.67±0.14*△1.58±0.19#△1.90±0.11*&2.49±0.20*TRAF6 1.00±0.06 1.55±0.04*1.17±0.07△1.23±0.08#△1.12±0.07△1.38±0.04*

图2 各组含药血清高糖环境下雪旺细胞IRAK1和TRAF6蛋白表达电泳图

3 讨论

SCs是周围神经的髓鞘形成细胞［6］，其代谢紊乱易导致神经纤维出现髓鞘脱失，是DPN的主要病理特征［7］。研究发现，SCs容易受高血糖的影响，高糖环境下SCs的损伤和线粒体的功能障碍会导致轴突萎缩，髓鞘脱失等病理改变［8］，因此，可将高糖环境下培养的SCs作为DPN研究的体外模型。含药血清是由姜廷良教授引入中国的药理学实验技术，能够真实地反映药物的药效及其作用环境，在体外实验中可信度优于中药粗制剂［9］。因此本实验的体外实验采用高糖环境培养的SCs为研究对象，使用木丹颗粒含药血清为治疗药物干预SCs，结合体内实验，共同探讨木丹颗粒对TLR4通路的调控机制。

DPN的中医病机以气滞血瘀为主［10］，木丹颗粒在临床治疗DPN疗效显著［3-4］。方中黄芪为君药，可使气旺血行；三七、延胡索为臣药，功效为活血止痛；佐以赤芍、丹参、川芎、红花、苏木和鸡血藤，共同达到活血化瘀，通络止痛的作用［11］。我们在前期实验中对木丹颗粒治疗DPN的机制进行了研究，实验结果显示，木丹颗粒能够抑制DPN大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路和TLR4/p38 MAPK通路，进而抑制炎症反应，改善周围神经结构和功能的损伤。

微RNA（MicroRNA，miRNA）是高度保守的内源性非编码单链小分子RNA，长度20～25 nt，能够通过靶向信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’UTR区域碱基互补配对，从而抑制或降解靶标mRNA的翻译和表达［12］。miRNA在病理过程中发挥了重要的作用，能够作为疾病预警和早期诊断的生物标志物［13］。miR-146a参与急性和慢性炎症反应的调节已被广泛证明，有研究发现在miR-146a缺陷型小鼠中观察到炎症反应标志物的高表达［14-15］。此外，研究发现miR-146a参与了DPN的发生，并与炎症反应密切相关［5］。

IRAKl和TRAF6是miR-146a调控的两个主要靶基因，能够对炎症进行负反馈调控［16］。IRAK1和TRAF6是TLR下游通路中的两个重要分子［17］，TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活能够诱发炎症反应［18］，其 中MyD88能 够 与IRAKl和TRAF6形 成MyD88-IRAKs-TRAF6复合体进行信号转导，IRAK1和TRAF6的活化会引发NF-κB的核移位，从而促进炎症反应发生［19-20］。体内实验和体外实验均证明，木丹颗粒能够促进miR-146a的表达，并抑制IRAK1和TRAF6的蛋白和基因表达。

综上所述，木丹颗粒能够通过促进miR-146a的表达，进而抑制IRAK1和TRAF6的表达，从而调控TLR4/MyD88/NF-κB通路，抑制炎症反应，防治DPN。