蜡块脱钙法在常规病理技术制片中对组织染色效果及切片优良率的价值

林秋月 黄汉兴 吴海燕

（福建省莆田市第一医院，福建 莆田 351100）

随着生物学和医学的不断发展，切片技术通过不断优化改进而逐渐完善起来。现代切片技术不仅是病理检验技术中不可缺少的构成部分，而且已经成为生物形态学微观结构研究的一个重要方向。病理技术制片主要过程有取材、固定、脱水、包埋、切片、染色和封固。其中切片为关键点，切片质量直接会影响检验准确性。在常规病理技术制片中，经常出现一些经过处理的蜡块，如骨组织脱钙不全、小灶或者灶状钙化灶等。骨组织是一种坚硬的结缔组织，采取常规方法极容易发生脱钙不全状况，导致切片存在切痕明显、染色不均匀、切片不完整等情况，直接影响切片优良率，影响诊断效果。所以需要积极采取有效方法，促使能够全面去除钙质，保证染色效果和切片优良率。蜡块脱钙法利用脱钙液透过石蜡，能够有效清除骨组织和钙化灶、砂砾体内钙质，并且不会溶解石蜡。蜡块脱钙法具有较高安全性，并且操作简单，过程中不用换脱钙液。有学者认为，蜡块脱钙法在常规病理技术制片中能够保证组织染色效果，保证切片优良率[1]。鉴于此，此次研究则分析蜡块脱钙法在常规病理技术制片中对组织染色效果及切片优良率的价值，详细内容见下文。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2020年6月至2021年6月接收的100块脱钙不足、钙化灶以及砂砾体的蜡块按照随机数字表方式进行分组，50块采取常规脱钙法，设定为对照组，50块采取蜡块脱钙法，设定为观察组，分析两组方法产生的效果差异。此次研究仪器和设备：全自动脱水机、全自动石蜡包埋机、轮转式石蜡切片机、全自动染色、全自动封片机。脱钙液配置：甲醛30 mL，甲酸20 mL，盐酸30 mL，蒸馏水20 mL。把甲醛、甲酸以及盐酸依次加入到蒸馏水中，摇匀混合。本研究不违反国家法律法规，符合医学伦理原则。

1.2 方法 将接收的100块脱钙不足、钙化灶以及砂砾体的蜡块按照随机数字表方式分组，50块采取常规脱钙法，作为对照组；50块采取蜡块脱钙法，作为观察组。对照组直接将蜡块进行切片处理。观察组将蜡块上多余的蜡清理干净，然后将蜡块最大面显露出来，放置脱钙液里，和脱钙液有效接触，1 h后取出来后，清除依附的脱钙液。两组切片后，利用全自动染色机染色等操作，再利用显微镜观察。

1.3 观察指标 ①脱钙终点判断：以蜡块组织面钙化部分全面显露，能够切出完整的切片。②切片染色判断：光学显微镜下细胞核，细胞质着色清晰、层次分明、红蓝适度，则判定为染色满意。③切片质量判断：切片外观完整、平整、未发现空洞、厚薄均匀判断未组织结构完整。④切片优良率判断：10分（切片完整，贴片合适）；20分（切片厚度均匀，无污染）；30分（无固缩、龟裂碳化细胞核）；10分（封胶适当，玻片整洁）；10分（未发现皱褶）；10分（无刀痕）；5分（号码清晰，字体端正）。分值界为80分，80分以上为优，60～80分为良好，60分以下为差。优良率=（优+良）例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析。计量资料采用（）表示，组间比较行t检验；计数资料采用[n（%）]表示，组间比较行χ2检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分析两组蜡块切片优良率 观察组切片优良率明显较高，P＜0.05，差异有统计学意义。见表1。

表1 两组蜡块切片优良率比较[n（%）]

2.2 分析两组组织结构 对照组蜡块切片后组织结构多数存在残缺现象，只有29块较完整，完整率58.00%。观察组蜡块切片后组织结构完整有48块，完整率高达96.00%。观察组蜡块切片后组织结构完整率较高，差异有统计学意义（χ2=40.768，P=0.001）。

2.3 分析两组染色情况和染色满意度 观察组经过脱钙法脱钙后制作的切片细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，钙化灶呈现蓝色，沙砾体呈现紫红色，染色均一，效果满意度。观察组染色不均一。观察组染色满度94.00%，对照组染色满意度80.00%。观察组染色情况较好，染色满意度较高，差异有统计学意义（χ2=8.665，P=0.003）。

3 讨论

随着医疗水平的不断提高，生物染色技术不断更新和发展。采取组织切片染色方法，能够反映不同的细胞结构和形态以及成分之间的变化[2]。组织制片及组织染色技术在医疗科学领域里占有重要地位，是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。组织学切片所需的组织，除一部分可取自人体外（如外科手术活检组织或尸检的新鲜材料），大部均取自动物。其过程包括组织（细胞）取材、固定、包埋、切片、染色、封片。取材是制作切片程序中关键步骤。取材不当会直接影响患者病理诊断和科研工作效果。组织标本的选用极其重要[2]。随意的切取组织制作组织切片，病理检验效果往往无法达到满意评价。常规病理技术制片步骤为：首先的取材，选择的材料越新鲜越好。人体组织和机体分离，动物组织死亡后立即固定，保证原始形态的结构[3]。选择的材料大小要按照相关规定标准进行，促使固定液能够快速并且平均深入到组织中。由于不同材料生产目的也有所不同，组织体积也会不同。外部病理检查和科学研究过程中，组织大小可以缩小0.1 cm左右，这样能够缩短脱水实践和透明度。设计教学切片可以厚度保持在0.3～0.5 cm，这样以便于制作更多的学习板。采取切割物品时候需要保证锋利度，切割时不能将组织夹太紧，不然会挤压引起组织和细胞损坏。选择的材料需要保证根据自然解剖位置，不同病理部位进行准确采择。最后根据每个器官组织形态，生长结构进行切割。纵向和横截面一般指示组织形状和结构，如长管的器官需要横向。保持组织原始状态，新的组织会在一定程度上变化，可能会变多可能会变少，所以需要保证尽量保证组织原始状态。固定中小块组织固定方法是最常见并且也是经常应用的方法。在机体或者动物的体内采取的小组织需要及时置入液体固定剂里。样品和固溶液的比例为1:（4～20）。组织块不能太厚不能太大，不然会导致熔体无法迅速渗出。注射、灌注固定方法，在一些较难穿透的固定液或者组织过大，动物全部器官或者身体必须作为整体固定。利用这种方法，能够将固定流体全部注射到血管中，并分散到组织和机体，达到完全固定的效果[4]。蒸汽固定方法是利用于太小，太厚的组织样品中。脱水意思是样品固定和洗涤后，组织中剩余水量较多，需要更换组织中水平。为确保能够有效去除水平，采取石蜡和胶水。含水织物和石蜡，焦纤维黏合剂和其他包装材料不容，脱氢是不同浓度的乙醇。丙醇也是脱水剂，也具有较高的脱水能力。但是脱水能力较高，对组织也有较显著的影响。在教学中一般不采用这种方法。浸蜡、包埋意思是石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂。将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中。切片是根据组织尺寸，从组织边缘切下残余蜡，不然会导致组织收缩。将修复后的蜡块安置在金属或者木蜡框架上，将切割刀片安装在切割台中，拧紧固定螺钉，避免在此过程中振动。保持适当厚度，做好切割机厚度调节，根据需要选择厚度。利用镊子提起蜡条，放置在40～45 ℃水中。在水张力和温度作用下，蜡条会轻微起皱，自然光滑。在恒温水面，将圆盘铺平后，将蜡块移到玻璃载片中段，将剩下的水倒在玻璃载片上，放置在60～65 ℃的恒温箱内进行烘烤30 min，去蜡。染色和封片，在染色过程中，首先应保证各种试剂的浓度、体积，避免有沉淀[5]。用Harris苏木精液时，染色前要先用一张滤纸除去液体表面的结晶，以免污染切片。脱蜡彻底，不然易出现嗜碱性片状模糊，毛玻璃样现象，染色不均。严格控制乙醇梯度时间，以免水分过快进入细胞，破坏细胞结构，影响染色效果。切片脱水后，进行二甲苯时发生白色不透明情况，脱水不完全，需要及时更换乙醇。重新彻底脱水与透明。脱水完全的切片十分干净，透亮，有利于观察。封片树胶浓度尽量适当，太稀，易出现大气泡，影响观片效果。样本的质量取决于初始处理的准确性和效率，包括固定、脱水、插入等。选择所需的工具类型和适当的工具。此外，操作员的丰富经验对切片质量保证至关重要。操作员需要熟悉切片机的工作原理，消除常见错误并消除一些潜在影响因素[6]。

骨髓里存在较多骨髓细胞，可以激发各种血细胞到血液。骨组织中有较多钙化细胞和间质和数种细胞构成，钙化细胞间质又为骨基质，骨基质有机和无机成分能够有效融合，导致骨质十分坚硬，无法直接切割。脱钙不全切片容易被撕碎，损坏切片。在进行病理切片时，骨组织存在较多钙盐沉积，而结缔组织又十分坚硬，导致切片较困难。因此我们首先要清除钙化灶钙质里面的钙盐，保证组织能够变软，然后才能有效切片。当前，在常规病理制片技术工作中，寻找一种理想脱钙方法，不仅要保证切片染色效果，还要保证组织结构不能被破坏，完整保证组织抗原和超微结构保存完好，是当前病理技术重点解决问题。当前多数病理实验室采取的传统组织块脱钙方法，主要是采取材料固定后组织块放入到稀释溶液中进行脱钙，由于所用脱钙液种类不一样，所需要的钙时间也不一样，一般需要4～7 d，在不同程度上影响了对骨组织诊断和研究，并且还存在拖延制片时间问题，严重影响报告发放，严重影响患者诊断效果。在常规的病理制片过程中，时常会发现骨组织钙化不足、淋巴结组织钙化等情况，如果不进行处理，直接切片，则无法保证切片优良 率[7-8]。即使制作为切片，也会出现切片偏厚，存在明显刀痕，染色不均匀等情况，这样会直接影响切片优良率和组织诊断时间。采取蜡块脱钙法，即将蜡块上多余的蜡清理干净，然后将蜡块最大面显露出来，再将蜡块放入已经配制好的脱钙液中。将蜡块底部组织面和脱钙液直接接触，60 min后取出，利用自来水充分清除蜡块上的脱钙液。采取全自动染色机自动染色、脱水、透明，中性树胶封固，在显微镜下观察。蜡块脱钙法能够保证蜡块组织结构完整性，提高染色满意率和蜡块切片合格率。蜡块脱钙法采取的脱钙液能够透过石蜡、有效去除骨组织和钙化灶和沙砾机体内钙质而不溶解石蜡。蜡块脱钙法在整个脱钙过程中时间较短，只需要30～60 min，这样能够有效提高工作效率，同时又能够很大程度提高切片优良率，满足病理诊断。蜡块脱钙法优势较多，如安全可靠、操作简单等，是骨组织脱钙不足有效的弥补方法。有研究将脱钙液进行脱钙，将选择好的组织块放入到脱钙液中稀释脱钙，脱钙时间不仅长，且不同的脱钙液具有不同的脱钙时间，至少需要2 d，最长也需要7 d时间才能脱钙，这样对骨组织研究具有较大的影响，还会出现脱钙不足、钙化灶、砂砾体等状况。如果直接切片，还会导致切片合格率不高，染色不均等状况，导致诊断准确性严重受到影响。蜡块脱钙法在常规病理技术制片中效果十分明显，能够保证组织结构完整性，不会出现切片痕迹，并且切片染色均匀，能够提高诊断准确性。蜡块脱钙法能够促使骨组织钙质彻底被清除掉，并且在脱钙过程中可以不用更换脱钙液。除外，脱钙时间较短，能够有效提高工作效率。此次研究则分析蜡块脱钙法在常规病理技术制片中对组织染色效果及切片优良率的价值。结果发现，对照组蜡块切片后组织结构多数存在残缺现象，只有29块较完整，完整率58.00%。观察组蜡块切片后组织结构完整有48块，完整率高达96.00%。观察组蜡块切片后组织结构完整率较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。通过分析两组切片完整率能够直接反映，采取蜡块脱钙法能够有效保证切片组织完整性，保证组织结构完整性，使其减少切片损坏等情况。观察组经过脱钙法脱钙后制作的切片细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，钙化灶呈现蓝色，沙砾体呈现紫红色，染色均一，效果满意度。观察组染色不均一。观察组染色满度94.00%，对照组染色满意度80.00%，观察组染色情况较好，染色满意度较高，差异有统计学意义（P＜0.05）为。通过分析两组染色情况和染色满意度能够直接反映采取蜡块脱钙法染色情况较好，染色满意评价较高。蜡块脱钙法能够促使切片细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，钙化灶呈现蓝色，沙砾体呈现紫红色，保证染色均匀，从而符合染色要求，达到染色满意目的。对照组切片优良率为84%，观察组切片优良率为98%。观察组切片优良率明显较高，差异有统计学意义（P＜0.05）为。通过分析两组切片优良率能够直接反映采取脱钙法脱钙后切片优良率较高，且安全可靠。脱钙法脱钙在常规病理技术制片中具有重要意义。在制片过程中为保证制片优良率，需要注意的点较多。组织染色前必须要完全脱蜡，脱蜡不完全会直接影响染色。染色时间和新老染色制备液存一定关系。新型制备染液染色能力高，染色时间可相应缩短。注意封固的树胶浓度要适当，不能产生气泡。树胶较稀，会冒出，并且还会散发。树胶太浓，不容易扩散，不容易排出，封固以后，还容易影响切片。染色后注意细胞染色平坦。如果分层不够深，会直接影响观察。切片从深蓝色到红色到粉红色，注意颜色变化。切片要及时放置水中，避免分化。取材组织块时，尽量避免挤压损伤。对典型或者具有教学和科研价值的标本，不能因取材导致对标本造成认为病变。肠黏膜组织上沾有少量的粪便，也不能用手擦拭或者用水洗净。切缘组织块应该尽量避免弯曲扭转。取组织应该在病灶和正常组织交界处。组织形状最佳方形或者长方形状，这样以便于制片。组织厚度需要均匀[9]。组织块厚度影响固定速度，如果组织厚度不均匀，在脱水时则会引起标本变形，影响制片。组织内钙化病灶或者骨质，需要充分固定后进行脱钙处理，组织内非病理性物应予以清除[10-11]。

综上所述，蜡块脱钙法在常规病理技术制片中对组织染色效果及切片优良率具有较高的价值，值得重视并采纳。