高效液相色谱法测定酿酒葡萄中单宁酸的含量

◎ 张学玲，刘 霞，蒋 媛，葛 谦，董 川，牛 艳，王晓菁

（1.宁夏回族自治区食品检测研究院，国家市场监管重点实验室（枸杞和葡萄酒质量安全），宁夏 银川 750002；2.宁夏回族自治区农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏 银川 750002；3.宁夏回族自治区农产品质量安全标准研究与评价重点实验室，宁夏 银川 750002）

葡萄产业是宁夏农业发展的优势特色产业和自治区六大支柱产业之一，已初步形成规模化。酿酒葡萄因皮厚、果肉少、汁多、糖分含量高、种子较大、单宁含量高而被用于葡萄酒的酿造。在葡萄酒中，单宁的数量、种类对葡萄酒的口感、结构、风味以及营养价值均具有重要的影响[1]。研究表明，单宁可以稳定红葡萄酒的色素，使其保持鲜活的颜色，也能使酒体更加坚实饱满、余味持久[2]。单宁不仅可以保护葡萄本身的天然花色苷，还可以防止花色苷被氧化，对pH、氧气和二氧化硫更为稳定[3]。单宁作为红葡萄酒的骨架，能在感官上带来苦味和涩味，欠缺单宁的葡萄酒往往瘦弱寡淡，风味不足。

单宁酸又称鞣酸、单宁或丹宁酸，化学式为C76H52O46，是一种天然的多酚化合物。单宁酸含有的多酚基团具有很强的生理活性功能，能够抗氧化[4-8]、抗菌[9-13]、收敛[14-15]、抗肿瘤和抗癌变[16-17]等，具有广泛的应用价值[18]。

分光光度法[19-20]是检测单宁酸的主要方法，但该方法测定的是以没食子酸为主的单宁类化合物的总量，而非单宁酸含量。近年来，高效液相色谱法也逐渐被运用于样品中单宁酸含量的测定中[21-22]，但相应报道较少，且关于酿酒葡萄中单宁酸含量的测定暂未见相关报道。因此，本文以宁夏产区酿酒葡萄为主要原料，采用振荡辅助提取酿酒葡萄中单宁酸成分，通过前处理（提取试剂、提取体积、振荡时间等）和仪器条件优化，建立了基于高效液相色谱法测定酿酒葡萄中单宁酸含量的方法，以期为完善宁夏地区酿酒葡萄质量标准体系构建提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

于2021年7—9月在贺兰山东麓酿酒葡萄种植基地，采摘幼果期、收获期酿酒葡萄。每次随机于植株东、西两侧分别采集果穗各1 穗，共6 穗，采集品种7 种，包括霞多丽、雷司令、赤霞珠、蛇龙珠、西拉、马瑟兰和美乐。所采样品去除异常果粒后经破壁料理机打浆，放置在-20 ℃冰箱中冷冻保存。

对照品单宁酸（CAS：1401-55-4，含量98%）；乙腈、甲醇、正己烷、丙酮（色谱纯，美国默克公司）；磷酸(色谱纯，美国天地公司)。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪-UV 检测器（Waters e2695-2487，美国沃特世公司）；低速台式大容量离心机（TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）；振荡器（THZ-82A，金坛荣华仪器公司）；高速匀浆机（T18 basic 型，德国IKA 公司）；电子天平（PL202-L 型，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；涡旋混合器（IKA MS 3 basic型，德国IKA 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

AQ-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm ）；柱温：30 ℃；流动相：0.1% 磷酸水溶液- 乙腈（95∶5，V∶V）；流速：0.8 mL·min-1；紫外检测器波长：280 nm；进样量：1 μL。

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取单宁酸对照品适量（精确至0.01 mg），置棕色小瓶中，用刻度吸管移10 mL 甲醇充分溶解，配制成质量浓度为1 000 mg·L-1的对照品储备液，避光-18 ℃保存。每次取用时，准确移取适量的对照品储备液，用甲醇定容，配制成所需系列浓度的标准工作溶液。

1.3.3 样品提取

称取酿酒葡萄样品3.0 g 于50 mL 的离心管中，加入25 mL 8∶2（V∶V）甲醇溶液，振荡20 min，于4 000 r·min-1离心3 min，经0.22 μm 的滤膜过滤后用于高效液相色谱仪分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

研究表明[22]，单宁酸的最大吸收波长为280 nm，故选择该波长为液相紫外检测器的检测波长。选择Ultimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水为流动相，进行对比分析。结果表明，采用Ultimate AQ-C18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，可实现与干扰组的有效分离。该条件下单宁酸标准品为单一峰，且峰型对称，相对保留时为11.910 min 左右，重现性好，单宁酸标准品色谱图见图1，酿酒葡萄中单宁酸色谱图见图2。

图1 单宁酸标准品色谱图

图2 酿酒葡萄中单宁酸色谱图

2.2 酿酒葡萄中单宁酸前处理方法的建立

2.2.1 提取试剂的优化

单宁酸具有较强的极性，极易溶于水和一些有机溶剂如甲醇、乙腈、乙酸、乙酸乙酯等，而在三氯甲烷、正己烷中均不溶，本文选取丙酮、乙酸乙酯、甲醇3 种有机试剂对酿酒葡萄中单宁酸进行提取。结果发现3 种试剂均能提取出酿酒葡萄中单宁酸成分，结合仪器色谱条件、试剂安全性使用及实验操作方便性，选取甲醇作为提取剂。但实验发现，以甲醇为提取剂时，单宁酸回收率较低，故进一步通过加标回收实验对甲醇-水（体积比）进行优化，实验结果见图3。随着提取体系中甲醇比例的增大，单宁酸回收率呈先上升后下降趋势，甲醇-水的体积比为8∶2 时，单宁酸回收率最高，达92%。

图3 不同比例甲醇-水（体积比）提取条件下酿酒葡萄中单宁酸的回收率图

2.2.2 提取剂体积及振荡时间的优化

酿酒葡萄称样量不变，考察提取剂体积、振荡时间变化对单宁酸回收率的影响，结果见图4、图5。提取剂体积增大可以有效提高单宁酸的回收率，当提取剂体积≥25 mL 时，单宁酸的回收率均可以达到97%以上，考虑到有机试剂的有效合理使用，确定提取剂体积为25 mL。在前面优化的基础上，改变振荡提取时间，结果发现当振荡时间≥20 min 时，单宁酸的回收率均能符合检测方法要求，考虑到节能减耗，振荡时间选取20 min。

图4 不同提取体积下酿酒葡萄中单宁酸回收率图

图5 不同振荡时间下酿酒葡萄中单宁酸回收率图

2.3 标准曲线、检出限、定量限

分别配制0.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、40.0 mg·L-1、60.0 mg·L-1、80.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1单宁酸标准溶液，按照已优化的色谱条件分别进样，以单宁酸的峰面积对质量浓度作图，绘制单宁酸线性标准曲线图。曲线方程为y=2 736.9x-1 931.8，R为0.999 8，说明单宁酸浓度为0.5～100.0 mg·L-1时其线性关系良好。

称样量为1 g，定容体积为50 mL，以3 倍信噪比计算仪器检出限，单宁酸的检出限为0.2 mg·kg-1；采用加标回收实验确定本方法中定量限为0.5 mg·kg-1。

2.4 稳定性实验

取同一酿酒葡萄样品提取液，将样品在室温下分别放置0 h、2 h、5 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 后，按已建立的色谱条件，采用高效液相对不同放置时间下的酿酒葡萄样品提取液进行测定，根据单宁酸峰面积计算RSD 值。结果显示RSD 值为2.6，表明供试品溶液在24 h 内的稳定性良好。

2.5 准确度与精密度

分别在酿酒葡萄基质中添加0.5 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-1和20.0 mg·kg-14 个浓度水平的单宁酸标准溶液，每个水平重复5次，测定其回收率。由表1可知，在4 个浓度添加水平下，酿酒葡萄中单宁酸的平均回收率在88%～96%，相对标准偏差在0.7%～6.0%，符合检测要求。

表1 酿酒葡萄中单宁酸的添加回收率和精密度结果表（n=5）

2.6 酿酒葡萄样品中单宁酸含量的测定及差异性分析

采用已建立的酿酒葡萄中单宁酸检测分析方法，对同一天采集的不同品种酿酒葡萄幼果和成熟果中单宁酸含量进行测定，并采用SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析，结果如图6所示。

图6 不同品种酿酒葡萄幼果和成熟果中单宁酸含量图

因品种差异，7 个品种酿酒葡萄幼果和成熟果中的单宁酸含量有极显著差异性（P＜0.01）。幼果期，白葡萄中雷司令的单宁酸含量高于霞多丽；红葡萄中西拉的单宁酸含量最高，表现为西拉（17.9 mg·kg-1）>马瑟兰（9.2 mg·kg-1）>美乐（7.2 mg·kg-1）>蛇龙珠（5.0 mg·kg-1）>赤霞珠（4.5 mg·kg-1）。经生育期变化，成熟果中单宁酸的含量累计增加远高于幼果，白葡萄中雷司令单宁酸含量高于霞多丽，红葡萄中西拉（164.2 mg·kg-1）>蛇龙珠（131.1 mg·kg-1）>赤霞珠（95.1 mg·kg-1）>马瑟兰（92.4 mg·kg-1）>美乐（72.3 mg·kg-1），与幼果相比存在差异。幼果到成熟果，单宁酸累计增长量表现为西拉（146.3 mg·kg-1）>蛇龙珠（126.1 mg·kg-1）>赤霞珠（90.6 mg·kg-1）>马瑟兰（83.2 mg·kg-1）> 美 乐（65.1 mg·kg-1）> 雷 司 令（33 mg·kg-1）>霞多丽（27.6 mg·kg-1）。白葡萄品种较红葡萄品种，幼果果实中单宁酸含量差异不大，但经生育期变化至成熟果，单宁酸含量远低于红葡萄品种。

3 结论

通过前处理及仪器条件优化，建立了酿酒葡萄中单宁酸高效液相色谱分析法。结果表明单宁酸在浓度为 0.5～100 mg·L-1时，与响应值呈线性关系，相关系数R为0.999 8；单宁酸回收率在88%～96%，RSD值为0.7%～6.0%，定量限为0.5 mg·L-1，样品在24 h内稳定，满足分析检测要求，可用于酿酒葡萄中单宁酸含量的测定。因品种差异，7 个品种酿酒葡萄幼果和成熟果中单宁酸含量均存在极显著差异（P＜0.01）。经生育期变化，各品种成熟果中单宁酸含量与幼果相比存在差异。幼果果实中白葡萄与红葡萄单宁酸含量差异不大，但经生育期变化至成熟果，白葡萄中单宁酸含量远低于红葡萄品种。