即食食品中6种致病菌恒温荧光快速检测方法的建立及应用

◎ 黄小真

（福州市产品质量检验所，福建 福州 350008）

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌是6 种常见的食源性致病菌，是国家食品安全监督抽检和食品风险监测判定微生物污染的6 个重要指标项目，2022 版国家食品安全监督抽检实施细则、GB 29921—2021、GB 31607—2021 以及GB 19298—2014 对即食食品中以上6 种致病菌进行了规定[1-4]。目前这6 种致病菌的检测方法还是传统的国标培养法，步骤烦琐，耗时长，完成6 种致病菌的检测通常需要3～7 d，不能满足食品制售企业和市场监督检验部门快速检测的要求，无法及时评价膳食风险。利用PCR技术同时快速检测即食食品中该6 种致病菌的方法可供参考甚少[5-7]。因此，建立一种可同时快速检测大批量食品中多种致病菌的方法是食品微生物检测研究的方向。

本项目针对即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌6 种致病菌，设计前增菌方法、选择Bst 聚合酶及特异性引物，采用一个恒温扩增条件，进行特异性试验和灵敏度试验，同时将该方法应用于市售食品样品的检测，建立一种快速检测即食食品中6 种致病菌的恒温荧光法，为食品安全快速检测和风险评估提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

沙门氏菌（ATCC14028）、金黄色葡萄球菌（ATCC8538）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC19115）、副溶血性弧菌（ATCC17802）、蜡样芽孢杆菌[CMCC（B）63303]以及铜绿假单胞菌（ATCC27853）6 株标准菌株购自北京陆桥技术股份有限公司；12 份市售食品样品包括包装饮用水、巴氏鲜奶、什锦谷物粉、瑞士卷、全脂高钙羊奶粉、冰淇淋、鲜虾沙拉、凉拌牛肉、生食三文鱼鱼段、鲜切芒果、柠檬无骨鸡爪以及海鲜寿司拼盘。

1.2 试剂与培养基

细菌基因组DNA 快速提取试剂盒；沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌6 种核酸检测试剂盒，均购自广州迪奥生物科技有限公司；缓冲蛋白胨水（BPW）、7.5%氯化钠肉汤、LB1增菌液、3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、SCDLP 增菌液以及营养琼脂等培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.3 仪器

ABI 7500Fast 实时荧光定量PCR 仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；SHP-250 生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Telstar Bio Ⅱ Advance 生物安全柜，泰事达机电设备（上海）有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样品预增菌

在洁净室中，分别称取25 g（mL）食品样品放入盛有225 mL 增菌液的无菌均质袋中，以10 000 r·min-1均质1 min 后进行培养，增菌液和培养条件见表1。

表1 6 种致病菌增菌液和培养条件表

1.4.2 细菌DNA 模板的制备

将增菌液摇匀，取100 μL 转移至预装900 μL DNA提取液的DNA 提取管中，涡旋振荡混匀，100 ℃条件下热浴10 min，室温放置10 min，完成后的上清液即为提取的核酸基因组。10 000 r·min-1离心2 min，将上清液转移至新的离心管中，可-20 ℃保存备用。

1.4.3 反应体系配制

根据6 种致病菌核酸检测试剂盒说明书配制反应体系，加入96 孔样品板中：每个待检样品需反应液22 μL，Bst聚合酶1.0 μL，密封液20 μL，DNA模板2 μL，每个反应体系25 μL。

1.4.4 恒温扩增反应

将配制好的反应体系混合后，10 000 r·min-1离心30 s，立即放入ABI 7500Fast 荧光PCR 仪进行恒温扩增，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，设置反应程序，将63 ℃ 15 s、63 ℃ 45 s 作为一个循环，于63 ℃ 45 s 处收集荧光信号，共45 个循环。

1.4.5 特异性试验

取实验室储存的6 种致病菌标准菌株复活培养，提取相应DNA 模板，用恒温荧光法检测，6 种致病菌各自空白增菌液作为阴性对照，验证该方法的特异性。

1.4.6 灵敏度试验

按表1前处理增菌方法，将各自菌液10 倍梯度稀释至10-9，每个稀释度取1 mL 进行营养琼脂培养平板计数，每个稀释度进行3 个重复。同时，选择3个合适稀释度（102～104）CFU·mL-1的菌液，各取1 mL进行DNA 提取后用恒温荧光法检测，验证该方法的灵敏度。

1.4.7 食品样品检测试验

用恒温荧光法同时检测12 份市售即食食品中的6种致病菌，同时按照GB 4789 系列国标方法[8-13]进行检测，比较两种方法检测结果的一致性和时效性。采用人工污染样品方法，分别取经过平板计数确定浓度为103CFU·mL-1的6 种致病菌纯菌菌液1 mL 加入12份市售食品样品中，用恒温荧光法检测，验证样品阳性检出率。试验方案见表2、表3。

表2 12 份市售即食食品试验方案表

表3 96 孔样品板试验方案样品编号表

2 结果与分析

2.1 方法特异性

采用恒温荧光法对6 种致病菌纯培养物进行检测，6 种致病菌均有相对应的特异性扩增曲线，阴性对照均无扩增曲线。阴阳性结果准确率为100%。因此，该试验建立的恒温荧光法特异性强。6 种致病菌恒温荧光扩增图谱见图1、表4。

图1 6 种致病菌恒温荧光扩增图谱图

表4 96 孔样品板试验结果表（Ct 值）

2.2 方法灵敏度

经过营养琼脂培养平板计数确定后，原始纯菌菌液经过10 倍梯度稀释后，选取菌液浓度（102～104）CFU·mL-13 个稀释度用恒温荧光法检测，该方法检测6 种纯菌灵敏度均达到103CFU·mL-1。

2.3 市售食品样品检测

12 份即食食品购于超市，有固体样品、半固体样品、液体样品，包括预包装食品、散装速食方便食品和鲜切水果等，分别采用恒温荧光法和国标培养法同时检测6 种致病菌。通过恒温荧光法和国标培养法检测发现，12 份样品检测结果均为阴性，12 份人工污染样品检出阳性菌，恒温荧光法与国标培养法检测结果一致性达到100%。针对12 份市售即食食品同时检测6 种致病菌，从样品制备到检测结果数据报送，恒温荧光法检测全过程耗时24 h，国标培养法检测全过程耗时7 d。

3 结论与讨论

本研究建立了即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌以及铜绿假单胞菌6 种致病菌同时快速检测恒温荧光法，该方法特异性强，对食品基质无特殊要求，检测灵敏度达到103CFU·mL-1，操作简单，检测结果稳定可靠。实际检测工作中遇到的食品样品复杂多样，需要检测的目标菌种类繁多，该方法基于96 孔样品板和相同的仪器试验条件，可满足同时检测不同食品样品的多种目标菌，极大地提高了检测效率，可用于食品安全突发事件应急检测。