全自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定大米中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素

◎ 张树权，周瑞铮，易华娟，林秋凤，郑耀林

（东莞市食品药品检验所，广东 东莞 523808）

香精所具有的浓郁香气可以起增香、定香的作用，其中香兰素及其衍生物的应用十分广泛，是使用最多的食品增香剂之一。乙基香兰素等香精通过人工合成的方式得到，而香兰素则存在于众多自然植物中，被提取出来后通过人工合成的方式进行大量生产，并广泛用于食品加工中。然而有关研究表明，过量食用香兰素等有出现头晕、恶心、呕吐、呼吸困难以及损伤肝肾等风险[1]，而香豆素更被列入第三类致癌物清单中[2]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[3]中明确规定大米中不得使用天然香精或合成香精，但为了提高大米的销售利润，常有不法商家在大米中添加香兰素等增香剂冒充优质大米。大米除了作为主食，还是重要的食品加工原料，大米的质量控制对人们的生命健康安全的重要性不言而喻。然而目前尚未颁布检测大米中香兰素等香精的食品安全国家标准，市场监督管理总局发布的食品补充检验方法《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定》（BJS 201705）[4]操作过于简单，不能有效除去大米中的杂质，尤其是可溶性脂类容易污染离子源，不利于仪器的维护使用。目前，针对香兰素等香精的研究主要考察的是奶粉[5-10]、饮料[11-15]、乳制品[16-17]和植物油[18-19]等基质，本文采用全自动固相萃取仪结合超高效液相色谱-串联质谱法对大米中香兰素等常见4 种香料进行检测，能够提高大批量检验的工作效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试样来源：所用15 批试样均为东莞市各大米厂家送检的大米。

标准品：香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素，纯度均不小于99%，批号分别为D0016913、D0019465、D0016050、F0031598，北京BePure 公司。

甲醇：色谱纯，德国默克公司；甲酸：分析纯，德国默克公司；固相萃取小柱：Oais HLB，60 mg/3 mL，美国沃特世公司；微孔滤膜：PTFE，孔径0.22 μm，天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 仪器与设备

TRIPLE QUAD 5500+超高效液相色谱串联质谱仪，美国AB SCIEX 公司；FotectorPlus 全自动固相萃取仪，中国睿科集团股份有限公司；CPA225D、BSA223S电子分析天平，德国赛多利斯公司；3K 15 离心机（9 500 r·min-1），德国Sigma 公司；Milli-QReference超纯水机，德国默克公司；BC-1000 涡旋振荡仪，深圳逗点生物技术有限公司；CPX880H-C 超声波清洗机，美国Branson 公司；Evatros 自动氮吹仪，韩国Goojung 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的制备

分别准确称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素标准品各10 mg，分别置于10 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1 mg·mL-1的单标准储备液。

分别准确吸取适量上述单标准储备液，用70%甲醇水溶液稀释至浓度均为10 μg·mL-1的混合标准溶液。

用70%甲醇水溶液将混合标准溶液稀释成质量浓度为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1标准系列工作溶液，临用时配制。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Atlantis T3（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱温：35 ℃；流动相：A 为0.1%甲酸水溶液，B 为甲醇；进样体积：1.0 μL；流速：0.3 mL·min-1；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱梯度：0～0.5 min，25%B；0.5～2.0 min，25%～50%B；2～4 min，50%B；4.0～4.1 min，50%～90%B；4.1～6.5 min，90%B；6.5～6.6 min，90%～25%B；6.6～10 min，25%B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（H-ESI+，正离子模式）；扫描模式：多反应监测；雾化气：50 psi（氮气）；辅助气：50 psi（氮气）；气帘气：30 psi（氮气）；喷雾电压：5 500 V；去溶剂温度：500 ℃；碰撞气：8 psi（氮气）。离子对优化结果见表1。

表1 离子对优化结果表

1.3.3 实验步骤

准确称取1.00 g（精确至0.01 g）试样，加入10 mL甲醇，涡旋振荡5 min，超声提取10 min 后，8 000 r·min-1离心5 min，转移全部上清液至玻璃试管，加入一级水将上清液稀释至40 mL，待净化。用全自动固相萃取仪将全部稀释液经过活化的HLB 固相萃取柱，再用3 mL 35%甲醇水溶液淋洗，抽干小柱，用3 mL 甲醇洗脱，用刻度试管收集洗脱液并于40 ℃氮吹浓缩至接近0.1 mL，准确加入70%甲醇水溶液至1 mL 刻度，涡旋振荡30 s，过0.22 μm PTFE 微孔滤膜后，待测。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择

常见的流动相体系有甲醇-水和乙腈-水体系，在此基础上正离子模式中常加入甲酸、乙酸铵等对峰形和保留时间进行改善。本实验对以上几种流动相体系进行比较，发现在同一梯度洗脱条件下，甲醇-水体系对甲基香兰素和乙基香兰素的分离效果优于乙腈-水体系；而加入甲酸或乙酸铵等缓冲盐的流动相对保留时间无明显影响，添加甲酸后各个组分的响应均有明显增强，但加入乙酸铵对各个组分的响应有明显的抑制作用。此外，本文比对了添加0.05%～0.20%甲酸对色谱峰的影响，结果发现增加酸浓度对分析物保留时间无明显影响，与相关文献[19-21]报道情况相符，综合色谱柱保养以及分离效果的考虑下，选用0.1%甲酸。因此，本文最终选用甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，该条件下色谱峰图谱见图1。

图1 色谱图

2.1.2 色谱柱的选择

由于香兰素等4 个组分均有一定的极性，且甲基香兰素和乙基香兰素互为同分异构体，对分离要求较高，因此本文选择对极性分子分离效果较好的3 根反相色谱柱进行比较。经过比较，在甲醇-0.1%甲酸水溶液体系下Atlantis T3 的峰形与分离效果较好，因此选用Atlantis T3 柱为色谱柱。

2.2 前处理方法优化

2.2.1 提取溶剂的选择

香兰素、甲基香兰素等4 个组分在醇类、酯类等极性有机溶剂中有较好的溶解性，且组分多呈弱酸性，因此本实验选取比较了1%氨水、甲醇、乙腈和乙酸乙酯等4 种提取溶剂，考察其对大米中香精的提取效率。在样品中加入浓度为10 μg·mL-1的混合标准溶液0.1 mL，即添加浓度为1 mg·kg-1，将样品混合均匀并静置30 min，用10 mL 上述4 种溶剂分别进行提取。由图2可知，1%氨水对香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的提取效率在85%以上，但对香豆素的提取效率不佳，只有30%左右；而乙酸乙酯对4 种组分的提取效率均在85%以上，甲醇和乙腈的提取效率均能达到90%以上，且甲醇略优于乙腈，因此3 种溶剂的提取效率为甲醇>乙腈>乙酸乙酯。在提取过程中，甲醇和乙腈的提取液较为澄清，样品离散效果好，而1%氨水和乙酸乙酯的提取液较为混浊。这是由于大米中的水溶性杂质和淀粉容易溶解在1%氨水中，油脂类杂质更易溶于乙酸乙酯中。此外，与乙腈相比，甲醇的毒性相对较小，价格低廉，适合大批量检验提取，且选取甲醇作为提取溶剂时，仪器基线平稳，无明显杂峰干扰。因此，本文选用甲醇作为提取溶剂。

图2 不同溶剂提取效率对比图

2.2.2 提取方式及时间的优化

本实验以甲醇为试剂进行提取，分别比较了涡旋振荡、超声提取以及两种方式混合提取的提取效果。在样品中添加适量标准储备液，制备成含量为1 mg·kg-1的加标样品，将加标样品充分混匀并静置30 min 后进行提取，分别于涡旋振荡、超声提取和复合提取的条件下测定其提取效率。结果表明，涡旋振荡和超声提取的时间分别在达到10 min 和20 min 后提取效率基本不再增加；涡旋振荡的整体提取效率只能达到90%左右，与超声提取（95%）相比略低，但超声提取所需时间较长；采用复合方式进行提取，在涡旋振荡5 min 并超声提取10 min 的提取条件下，不仅能获得同样的提取效果，还能缩减提取时间，因此最佳提取方式为涡旋振荡5 min 及超声提取10 min 的复合方式。

2.2.3 全自动固相萃取仪净化及氮吹浓缩处理

采用固相萃取柱处理样品，不仅能对样品溶液进行净化，降低样品的基质效应，还能浓缩样品溶液，富集检测目标物进而降低检验方法的检出限，但是固相萃取柱净化过程往往较为烦琐、且耗时较长。近年来，有研究表明[22-23]，全自动化的前处理辅助设备的需求和用途越来越大，全自动固相萃取仪可有效节省检验人员的时间，能自动同时处理多个样品，提高工作效率，而且仪器采用的全封闭式操作能大大降低污染和失误操作的风险，减小人为误差，能获得更好的回收率和精密度。本实验选取了HLB、MAX 和C183 款固相萃取小柱，并对净化效果进行比较。经过比对发现，C18对于各个组分的保留能力较弱，未能较好地吸附检测组分，这是由于香兰素、乙基香兰素等组分呈弱酸性且具一定的极性，因此具备阴离子吸附作用的MAX 固相小柱和亲水亲脂平衡型的HLB 的保留效果均较好，且HLB 固相小柱在35%甲醇-水溶液的淋洗条件仍对4 个检测组分具有极好保留能力，而MAX 在25%甲醇-水溶液条件下进行淋洗时检测组分随着甲醇比例的增加逐步开始流失，HLB 固相小柱的保留能力和净化除杂能力优于MAX 固相小柱，因此本实验选用HLB 固相小柱作为净化柱。在氮吹浓缩的过程中，发现浓缩液一旦完全吹干，将会使各个组分的回收率降低，而氮吹浓缩至0.1 mL时补液至1 mL，可有效避免检测组分的损失。

2.2.4 防止污染带入

香兰素用途广泛，除了在食品中应用外，还被用于橡胶、塑料等工业用品中，因此实验过程中的器具耗材可能会带入香兰素的污染，对实验结果产生影响。本实验对操作中使用过的器具耗材（塑料离心管、移液器枪头、一次性注射器、微孔滤膜、固相萃取柱、进样瓶盖及垫片等）使用玻璃器皿盛装，用适量甲醇浸泡并超声20 min，浓缩至1 mL 进行检测。发现聚丙烯、聚四氟乙烯等高分子材料的器皿耗材不会带入香兰素，而常用的尼龙微孔滤膜有香兰素溶出，浸出液浓度约为10 ng·mL-1，对实验结果造成一定的影响，容易造成假阳性的现象。因此本实验所用器皿耗材均为聚丙烯、聚四氟乙烯或玻璃材质。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系

本实验采用外标法，以系列标准溶液的质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。如表2所示，各组分在1～500 ng·mL-1线性关系良好，相关系数R均大于0.999。以定量离子的3 倍信噪比（S/N=3）为检出限，测定各组分的检出限，发现各组分的检出限为1.5～4.7 μg·kg-1。

表2 线性范围、线性方程、相关系数、检出限表

2.3.2 加标回收率及精密度

选取低（10 μg·kg-1）、中（50 μg·kg-1）、高（100 μg·kg-1）3 个添加水平，每个添加水平平行称取6 份样品，按1.3.3 的步骤对样品进行处理，测定方法的回收率及其精密度。如表3所示，各组分回收率在80.1%～89.3%，RSD 为1.7%～3.9%，满足日常检验的要求。

表3 加标回收率和相对标准偏差表（n=6）

2.4 样品实测结果

本实验对东莞市多家粮食生产企业以及其他省份粮食生产企业生产的15 批市售大米中香兰素等4 种香精的含量进行了测定。结果显示，所检样品中均检出香兰素，样品中香兰素含量为52.3～242.8 μg·kg-1，甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素均未检出。采用市场监督管理总局发布的食品补充检验方法《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定》（BJS 201705）重新测定香兰素含量，测得样品中香兰素含量为55.1～258.3 μg·kg-1，同一样品测定结果的相对平均标准偏差为4.1%～9.4%，说明本实验方法具有实际可行性。

3 结论

本研究建立了全自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定大米中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素4 种香精的分析方法，以甲醇为溶剂进行提取，经涡旋和超声提取，用水稀释后通过全自动固相萃取仪，使用Oasis HLB 固相小柱净化，氮吹至近干后复溶上机。结果发现4 种香精在质量浓度为1～500 ng·mL-1时线性关系良好，平均加标回收率在80.1%～89.3%，RSD 为1.7%～3.9%。该方法增加固相萃取步骤进一步净化样品，同时利用全自动固相萃取仪实现样品净化全自动化操作，相比现有的大米检测方法极大节省了时间和人力，简便有效，能为相关食品安全的检验工作提供一定的技术参考。