乙基多杀菌素的液相色谱分析

2021-12-09杨宝萍韦红慧韦元杰李晓昀

世界农药 2021年11期

杨宝萍，韦红慧，韦元杰，李晓昀

(广西速竟科技有限公司，广西南宁 530007)

乙基多杀菌素，英文名称：spinetoram，是放线菌刺糖多孢菌发酵产生的，是多杀菌素的换代产品，具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性特点，广泛应用于农业生产中[1-2]。其原药的有效成分是乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的混合物(3∶1)，二者的杀菌生物活性无显著差异[1]。分子式：乙基多杀菌素-J为 C42H69NO10，乙基多杀菌素-L为C43H69NO10[1]。

目前国内有关乙基多杀菌素农药产品的分析方法尚未见公开报道，导致乙基多杀菌素在农药监督执法中处于盲区。基于此，本研究采用液相色谱技术开展了60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂及25%水分散粒剂的分析研究以期为该药剂产品质量控制及标准制定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂和25%乙基多杀菌素水分散粒剂，由美国陶氏益农公司提供。

1.2 试剂和溶液

甲醇，色谱纯；乙醇，色谱纯；水，超纯水；乙酸铵；乙酸铵溶液：称取2 g的乙酸铵，溶于1 000 mL超纯水中，超声波振荡10 min；乙基多杀菌素标样：已知质量分数 97.3%，德国 Dr.Ehrenstorfer公司提供。

1.3 仪器设备

1260高效液相色谱仪具有二极管阵列检测器、自动进样器和色谱工作站(美国安捷伦公司)；色谱柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不锈钢柱，内装 C18、5 μm填充物；低有机物型超纯水机。

1.4 高效液相色谱分析条件

流动相：ψ(甲醇∶乙腈∶乙酸铵溶液)＝45∶45∶10 (体积比)；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：245 nm；进样体积：5 μL；在此色谱条件下，乙基多杀菌素的保留时间：乙基多杀菌素-J约17.5 min，乙基多杀菌素-L约20.4 min，乙基多杀菌素标样及样品典型液相色谱图见图1-3。

图1 乙基多杀菌素标样的液相色谱图

图2 60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂的液相色谱图

图3 25%乙基多杀菌素水分散粒剂的液相色谱图

1.5 测定步骤

1.5.1 标样溶液的制备

称取50.0 mg (精确至0.1 mg)乙基多杀菌素标样于50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超声波振荡5 min，冷却至室温，用甲醇定容，摇匀。

1.5.2 试样溶液的制备

称取含50.0 mg (精确至0.1 mg)乙基多杀菌素的试样于50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超声波振荡5 min，冷却至室温，用甲醇定容，摇匀，过滤。

1.5.3 测定

在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻2针乙基多杀菌素(J+L)峰面积相对变化小于1.2%后，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.5.4 计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中乙基多杀菌素(J+L)峰面积分别进行平均。试样中乙基多杀菌素质量分数ω(%)，按公式(1)计算：

式中：A1为标样溶液中乙基多杀菌素(J+L)峰面积的平均值；A2为试样溶液中乙基多杀菌素(J+L)峰面积的平均值；m1为乙基多杀菌素标样的质量，单位为克(g)；m2为试样的质量，单位为克(g)；ω1为标样中乙基多杀菌素质量分数，以%表示。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

乙基多杀菌素的紫外扫描光谱图如图4所示，从图中可以看到乙基多杀菌素的最大吸收波长约245 nm，在该波长处灵敏度较高，干扰较少，能够满足分析的要求，故将检测波长确定为245 nm。

图4 乙基多杀菌素的紫外光谱图

色谱柱选择常用的 C18反相柱。根据乙基多杀菌素物化性质和溶剂的紫外吸收波长，选择甲醇作为溶剂溶解样品。先用甲醇或乙腈和水作为流动相，未见有色谱峰。在以甲醇或乙腈和乙酸铵溶液作为流动相，保留时间较长，且出峰效果没有用甲醇+乙腈+乙酸铵溶液作为流动相的好。故选择甲醇+乙腈+乙酸铵溶液作为流动相。先分别选用不同比例的甲醇、乙腈和2%乙酸铵溶液作为流动相，发现有杂质峰干扰乙基多杀菌素，峰纯度达不到试验要求。故再分别选用不同比例的甲醇、乙腈和0.2%乙酸铵溶液作为流动相。将流动相按不同比例在色谱柱上进行试验，随着甲醇和乙腈比例的增加，保留时间减小，当甲醇、乙腈与0.2%乙酸铵溶液比例达到45∶45∶10时，乙基多杀菌素色谱峰与各杂质完全分离，峰纯度达到试验要求，最终选择Ψ(甲醇∶乙腈∶0.2%乙酸铵溶液)=45∶45∶10作为流动相，流速1.0 mL/min。该条件下，乙基多杀菌素色谱峰峰形较好，与杂质能完全分离，具有良好的精密度和准确度，并且分析时间较短，提高了工作效率。

2.2 特异性试验

本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别乙基多杀菌素。乙基多杀菌素标样、60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂和 25%乙基多杀菌素水分散粒剂中的乙基多杀菌素HPLC-DAD峰纯度均大于990，有效成分处无其他物质干扰，符合定量分析要求。峰纯度色谱图见图5-7。

图5 乙基多杀菌素标样HPLC-DAD峰纯度色谱图

图6 乙基多杀菌素悬浮剂HPLC-DAD峰纯度色谱图

图7 乙基多杀菌素水分散粒剂HPLC-DAD峰纯度色谱图

2.3 线性关系试验

按1.5.1节分别配置5个不同质量浓度的乙基多杀菌素标样溶液，在相应色谱操作条件下进行分析，以乙基多杀菌素质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(图8)。当乙基多杀菌素质量浓度为178.4~1 872.8 mg/L，得到线性方程为y=4.41x-52.17，线性相关系数R=1.00。

图8 乙基多杀菌素峰面积与质量浓度线性关系图

2.4 方法精密度试验

按 1.5.2节试样溶液的制备方法分别配制 5个60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂和5个25%水分散粒剂溶液。以线性关系试验中860.9 mg/L乙基多杀菌素溶液为标样溶液，在上述操作条件下，待仪器基线稳定后进行测定，结果见表1、2。可以看出悬浮剂和水分散粒剂测定结果的RSD分别为 0.19%和0.34%，分别小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=2.05和1.67，说明分析方法精密度的结果符合质量控制的基本要求。

表1 60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂精密度试验结果

2.5 方法准确度试验

称取含25.0 mg (精确至0.1 mg)乙基多杀菌素的60 g/L乙基多杀菌素悬浮剂和25%水分散粒剂于50 mL容量瓶中各5份，分别加入乙基多杀菌素标样25.0 mg，按1.5.2节的方法配制有效成分准确度溶液各5份。以线性关系试验中860.9 mg/L乙基多杀菌素溶液为标样溶液，计算乙基多杀菌素的回收率，结果见表3、4。悬浮剂和水分散粒剂中乙基多杀菌素平均回收率分别为 101%、100%，具有良好的准确度。