复合纳米二硫化硒体外抗念珠菌作用探讨*

刘巧灵，李培芬，孙细欢，仝莹莹，黄东红△

福建医科大学附属第二医院：1.检验科；2.微生物实验室，福建泉州 362000

随着免疫治疗发展，广谱抗菌药物的使用及介入治疗增多，机会性真菌感染发生率越来越高，尤其是外阴念珠菌感染成为临床的常见病和高发病，严重影响患者的生活质量[1-2]。传统抗真菌药物常常通过抑制细胞壁合成或破坏细胞膜功能而起到抑制真菌或杀灭真菌的作用。传统抗真菌药物抗念珠菌治疗效果慢、疗程长，且常存在着较严重的不良反应及耐药性，给临床治疗带来极大的困难[3]。因此，研究新型抗菌药物或对现有抗念珠菌药物进行改造增强抗念珠菌效果成为临床研究的热点和重点。纳米材料因表面积增大和晶格破损可产生特殊的物理化学性质，可以此构建具有新型物理性质和化学性质的化学材料。其中，有研究表明纳米银和纳米氧化镁是具有较强抗菌作用的纳米材料[4]。二硫化硒具有抗真菌、抗皮脂溢出的作用，可用于治疗花斑癣、多色蛇皮癣等皮肤疾病[5-6]。本文通过探讨复合纳米二硫化硒对念珠菌的抑菌(杀菌)作用，以期发现复合纳米二硫化硒在念珠菌感染治疗中的价值。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2019年1-6月福建医科大学附属第二医院临床微生物实验室来自于呼吸道、创面、泌尿生殖道、血液及无菌体液等的真菌培养标本，标本接种于沙保罗平板(广州迪景工程有限公司)，采用YST鉴定卡(法国生物梅里埃公司)、VITEK2 Compact全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)鉴定。选择10株白念珠菌、10株热带念珠菌、10株近平滑念珠菌共30株临床常见念珠菌进行试验。质控菌株：近平滑念珠菌标准株ATCC22019、克柔念珠菌ATCC6258，购自中国菌种资源库保藏中心，于-80 ℃保存。

1.2材料来源 本研究所用纳米材料为复合纳米二硫化硒，来自泉州师范学院杨大鹏团队，其透射电镜图见图1。

图1 生物模板法合成复合纳米二硫化硒的透射电镜图

1.3抗菌实验

1.3.1平板扩散实验 念珠菌培养：将临床获得的30株念珠菌(10株白念珠菌、10株热带念珠菌、10株近平滑念珠菌)在培养基上转种2次，保证念珠菌的纯度及活力，35 ℃孵育24 h后备用；涂板：挑选已分离纯化的3个以上单个菌落配制成0.5麦氏浊度菌液，用无菌棉签蘸取适量溶液，在MH琼脂平板上均匀涂3次，35 ℃培养24 h，另设置无菌磷酸盐缓冲液(PBS)阴性对照培养板。打孔：利用一次性无菌枪头打孔，在琼脂平板上均匀打3个孔，直径为0.7 cm；加样：配制一系列浓度梯度纳米二氧化硒溶液，注入已经打好的孔中，每孔50 mL；观察：将平板放入35 ℃微生物培养箱中，培养24 h后用游标卡尺量抑菌圈大小。每孔重复实验3次取平均值。

1.3.2微量肉汤稀释法 最小抑菌浓度(MIC)板制备：将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，10 μL，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20 ℃以下保存备用。菌悬液配制：挑选已分离纯化的3个以上单个菌落配制成0.5麦氏浊度菌液备用，经MH肉汤1∶1 000稀释后，向96孔板中每孔加100 μL菌液，密封后置于35 ℃普通空气孵箱中，孵育16～20 h判断结果[7]，于Multiskan Sky全波长酶标仪(美国Thermo Fisher公司)上检测波长570 nm处各孔的吸光度(A)值，以细菌生长明显被抑制，且与第12孔生长对照光密度值相比，被抑制≥50%孔的最低浓度作为复合纳米二硫化硒的MIC，每孔重复3次取平均值。

1.4细胞毒试验 (1)选用人皮肤成纤维细胞进行皮肤细胞毒试验：复苏成纤维细胞FHH1，将细胞加至含胎牛血清的DMEM培养液中，置于CO2恒温培养箱中，培养24 h后换液处理。传代两次后胰蛋白酶消化细胞，用含胎牛血清的DMEM培养液配成细胞悬液，以0.4×105个/孔细胞接种于96孔板中，每孔100 μL，放置于CO2恒温培养箱中，37 ℃微生物培养箱中培养12 h至细胞贴壁。将复合纳米硫化铜材料配制成不同浓度，加至96孔板中，分别以培养基及溶剂作对照。(2)CO2恒温培养箱培养48 h后，加入CCK8试剂，每孔10 μL，继续培养4 h。选择450 nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔A值，记录结果，计算细胞存活率。

2 结 果

2.1平板扩散试验 30株念珠菌均显示大小不同的抑菌圈，在复合纳米二硫化硒浓度为25 mmol/L时，抑菌圈直径为25～32 mm，见图2。

注：A为浓度6.25 mmol/L；B为浓度12.5 mmol/L；C为浓度25 mmol/L；a、b、c为大小不同的抑菌圈。

2.2微量肉汤稀释法 通过对30株念珠菌药物敏感性分析，结果显示，复合纳米二硫化硒对临床常见的念珠菌有较好的抗菌作用，3种念珠菌的MIC在6.25～25.00 mmol/L。复合纳米二硫化硒对白念珠菌的MIC值为(17.50±6.45)mmol/L，热带念珠菌为(10.63±5.93)mmol/L，近平滑念珠菌为(14.38±7.82)mmol/L，复合纳米二硫化硒对白念珠菌的MIC值高于热带念珠菌(t=2.480，P=0.023)，与近平滑念珠菌比较，差异无统计学意义(t=0.973，P=0.343)；热带念珠菌和近平滑念珠菌的MIC比较差异无统计学意义(t=1.208，P=0.243)。见表1。

表1 肉汤稀释法对3种念珠菌的MIC(mmol/L)

2.3安全性分析 通过对复合纳米二硫化硒作安全性分析，结果显示，复合纳米二硫化硒所产生的细胞毒性较小，细胞存活率可达85%以上，安全可靠。见图3。

注：A为培养剂对照；B为溶剂对照；C为12.5 mmol/L的二硫化硒；D为6.25 mmol/L的二硫化硒；E为3.13 mmol/L的二硫化硒；F为1.57 mmol/L的二硫化硒。

3 讨 论

随着外科手术、介入性技术和器官移植手术的增加，外源性真菌进入人体的概率大大升高；肿瘤治疗术后放疗和化疗的增多、免疫抑制剂和抗菌药物的广泛应用导致免疫功能低下的人群的比例升高，这使得人体内的正常真菌菌群转变为致病性真菌，从而导致了侵袭性真菌感染的增多[8-9]。念珠菌是常见皮肤真菌感染类型，导致念珠菌感染严重的因素之一是迅速出现的耐药性[10]。目前，临床可用于治疗念珠菌感染的药物十分有限，主要有4类药物：唑类、多烯类、棘球菌素类和核苷酸类似物[11-12]。抗念珠菌药物的种类少及念珠菌感染日益增多导致了临床感染的情况日益严重，因此，寻求新型抗菌药物和材料刻不容缓，目前纳米技术取得了巨大的进展，跟传统的抗菌药物相比，纳米材料不易导致细菌耐药性的产生[13]。

纳米抗菌药物的抗菌机制主要是这些颗粒的纳米尺寸使它们能够附着在生物细胞的表面。由于纳米颗粒尺寸小，可以很容易地与细胞表面和细胞内的生物分子相互作用，纳米抗菌药物和生物分子之间的这种相互作用可以产生更好的信号，从而用于诊断和治疗疾病。研究显示，含硒物质具有抗肿瘤增殖作用，经结构研究发现这种含硒物质是一种硒-硫环状物，以二硫化硒形式存在，具有良好的抗氧化、抗菌作用[14]。

复合纳米抗菌药物的抗菌机制比较明确，主要是与细菌内的遗传物质相结合，抑制DNA、RNA和蛋白质的合成，使细菌失活；与细菌细胞膜相互作用，催化细菌细胞膜裂解,使细菌死亡；与细菌菌体内的化学基团结合，使蛋白酶丧失活性，导致细菌死亡；影响菌体内环境pH值，破坏细菌的生存体系；产生活性氧自由基，进一步氧化菌体外膜从而抑制或杀死细菌[15-16]。纳米抗菌药物具有持久性、耐热性、生物相容性和不易产生耐药性等优点，受到科研界的广泛认可和高度重视。国内外纳米抗菌药物的研究主要集中在抗菌性能方面。二硫化硒用于真菌性皮肤病的治疗已有多年，治疗效果不断被证实[5-6]。但复合纳米二硫化硒对念珠菌的抗菌作用报道较少。

本研究采用纳米抗菌药物二氧化硒对临床分离的白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌进行抗菌试验和细胞毒试验，发现在复合纳米二硫化硒浓度为25 mmol/L时，抑菌圈直径为25～32 mm，MIC为6.25～25.00 mmol/L，其中热带念珠菌的MIC最低(10.63±5.93)mmol/L；此外，复合纳米二硫化硒对念珠菌有很好的抑菌(杀菌)作用，并且对成纤维细胞的细胞毒性较小，成纤维细胞FHH1存活率可达85%以上。研究显示，含二硫化硒的洗发水可有效抑制头皮常见马拉色菌属繁殖，有助于重建头皮微生态平衡，改善酮康唑治疗后的溢脂性皮炎症状[17]。另有研究表明，单位立方厘米的念珠菌菌群表面积为(15～30)×103cm2[18]，而同体积的纳米粒子体表面积是念珠菌的约2万倍，纳米材料巨大的表面张力在真菌外形成封闭膜，一方面有效增加二硫化硒滞留时间，在保证二硫化硒抗真菌药效的同时可减少用药量，有助于减轻药物不良反应[19]；另一方面可阻断真菌汲取营养的途径，促进二硫化硒的抗菌效果[20]。

综上所述，复合纳米二硫化硒有较好抗念珠菌作用且安全性好，有望成为新型抗念珠菌药物，未来本课题组将进一步探讨二硫化硒抗念珠菌的作用机制，有助于新型抗念珠菌药物的研发。