HPLC双波长法同时测定金乌骨通胶囊中3种成分

史 娟，陈 贵，卢娅玲，安 军，张 华，邓言欢，吴 征

(黔南州检验检测院，贵州 都匀 558000)

金乌骨通胶囊来源于传统苗药，由葛根、淫羊藿、补骨脂等十味中药组成，功效为滋补肝肾、活血通络、祛风除湿，用于治疗骨质疏松、肝肾不足等症[1-2]。金乌骨通胶囊现行质量标准中含量测定指标为葛根素，缺少淫羊藿及补骨脂有效成分的含量控制。淫羊藿苷是淫羊藿中主含的黄酮类有效成分，补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂中主含的香豆素类有效成分，3种成分均作为含量测定指标广泛应用于相应药材及其制剂的质量控制，其中淫羊藿苷具有促进雌性激素合成、调节血脂、保护受损神经元等作用，补骨脂素和异补骨脂素具有促进骨生长和雌激素样作用[3-6]。在报道的金乌骨通胶囊淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素三种成分含量测定研究中，由于采用甲醇-水系统作为流动相，补骨脂素和异补骨脂素出峰较快，不能和其他成分较好分离[7]。本文采用乙腈-水系统作为流动相，双波长法同时测定金乌骨通胶囊中淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量，各成分均有较好的响应值，且分离度良好，为金乌骨通胶囊质量标准的提升提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260Ⅱ型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AG135型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；DK-98-ⅡA型恒温水浴锅(天津市泰斯特公司)；SK250LHC型超声仪(上海科导公司)。

1.2 材料

对照品：淫羊藿苷(批号：110737-202017，以98.1%计)，补骨脂素(批号：110739-201918，以99.6%计)，异补骨脂素(批号：110738-202016，以99.4%计)，均购于中国食品药品检定研究院；15批次金乌骨通胶囊样品来源于药品评价性抽检，生产厂家为贵州盛世龙方制药股份有限公司，具体信息见表1；狗脊、乌梢蛇、葛根、淫羊藿、木瓜、姜黄、威灵仙等阴性对照用饮片购于都匀市湘君大药房，土牛膝、土党参、补骨脂药材由药企提供，经黔南州检验检测院陈贵主任药师鉴定为正品，缺补骨脂和缺淫羊藿阴性对照样品的制备参照金乌骨通胶囊质量标准中的处方和制法；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用安捷伦Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(25∶75)为流动相；柱温：20 ℃；流速：1.0 mL/min；进样10 μL；双波长检测：246 nm(用于两种补骨脂素检测)和270 nm(用于淫羊藿苷检测)。

2.2 各溶液制备

2.2.1 对照品贮备液的制备 分别精密称取3种对照品，用甲醇溶解并定容成每1 mL中含淫羊藿苷1 516.6 μg、补骨脂素1 257.0 μg和异补骨脂素1 529.8 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取适量的金乌骨通胶囊内容物，研细，取约1 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，称定重量，置于水浴上回流30 min，放冷，再称定重量，减失的重量用甲醇补足，滤过，取续滤液即得。

2.2.3 阴性供试溶液的制备 按处方组成及生产工艺，分别制备缺补骨脂和缺淫羊藿的两种阴性供试品，照“2.2.2”项下方法分别制备相应的阴性供试品溶液。

2.3 专属性及系统适应性试验

取“2.2.2”和“2.2.3”项下3种溶液及“2.4”项下定容至50 mL的混合对照品溶液，照“2.1”项下条件进样。结果表明供试品色谱图中显示与对照品相同保留时间的色谱峰，峰形较好，与相邻峰分离度均大于1.5，理论塔板数按3种成分计算均大于6 000，阴性对检测没有产生干扰。HPLC色谱见图1。

注：A.混合对照品(270 nm)；B.混合对照品(246 nm)；C.金乌骨通胶囊样品(270 nm)；D.金乌骨通胶囊样品(246 nm)；E.缺淫羊藿阴性对照(270 nm)；F.缺补骨脂阴性对照(246 nm)；1.淫羊藿苷；2.补骨脂素；3.异补骨脂素。

2.4 线性关系考察

分别取“2.2.1”项下的混合对照品贮备液1 mL置于10、25、50、100和200 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到5个浓度对照品溶液。取上述溶液按照“2.1”项下条件分别进样测定，以各对照品的质量浓度为横坐标(X)、其对应的峰面积为纵坐标(Y)作线性回归，结果见表2。

表2 3种成分线性关系

2.5 精密度试验

取“2.4”项下定容至50 mL的混合对照品溶液，照“2.1”项下条件重复进样测定6次，结果淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素3种成分峰面积的RSD分别为0.06%、0.12%和0.05%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取金乌骨通胶囊样品(批号：210117)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下条件分别测定供试品制备后0、2、4、6、8和12 h的含量，结果测得淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素3种成分含量的RSD分别为1.85%、0.39%和0.68%，表明供试品溶液在制备后12 h内稳定。

2.7 重复性试验

取金乌骨通胶囊样品(批号：210117)，按“2.2.2”项下方法制得6份重复性试验用溶液，照“2.1”项下条件测定，结果测得淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素3种成分含量平均值分别为0.609 mg/g、0.557 mg/g和0.757 mg/g，RSD分别为0.93%、0.18%和0.29%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

分别精密称取3种对照品(淫羊藿苷10.09 mg、补骨脂素9.29 mg、异补骨脂素12.42 mg)置于500 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释制得加样回收用贮备液。取适量的金乌骨通胶囊(批号：210117)样品研细，精密称取6份，每一份0.5 g，分别精密加上述加样回收用贮备液15 mL，再分别精密加甲醇10 mL，称重后回流提取30 min，放冷后再称重，减失的重量用甲醇补足，滤过，取续滤液照“2.1”项下条件测定，分别计算3种成分的加样回收率。结果见表3。

表3 3种成分加样回收率测试结果 (n=6)

2.9 样品测定

分别取不同批次的金乌骨通胶囊样品，每批次称取2份，供试品溶液按“2.2.2”项下方法制备，再按照“2.1”项下条件进样，采用外标法计算，3种成分含量测定结果见表4。

表4 15批次金乌骨通胶囊样品中淫羊藿苷等3种成分的含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长选择

实验在线采集淫羊藿苷等3种成分在200～400 nm范围内的吸收光谱，结果淫羊藿苷在270 nm、两种补骨脂素在246 nm处有最大吸收，在各自最大吸收波长处，各成分均有较好的响应值，且与相邻成分均有效分离，因此采用246 nm和270 nm双波长进行测定。

3.2 流动相选择

实验分别考察了甲醇-水(55∶45)和乙腈-水(30∶70)[8-10]作为流动相对3种成分分离的影响，结果在两种流动相条件下分离效果均不理想，但后者略优于前者，当把流动相调整为乙腈-水(25∶75)时，3种成分均得到有效分离。

3.3 提取条件选择

实验对提取条件进行考察，分析不同条件对3种成分提取的影响。提取方式考察超声和回流提取，提取溶剂考察稀乙醇、70%甲醇和甲醇，结果3种溶剂在回流条件下均有较好提取，其中以甲醇效果最好。然后考察甲醇的用量(25 mL和50 mL)以及回流的时间(15 min、30 min、4 min和60 min)，结果使用25 mL和50 mL溶剂提取无显著差异，回流30 min可达到3种成分的有效提取，因此提取条件选择用25 mL甲醇回流提取30 min。

3.4 方法耐用性

实验考察3种色谱柱[Agilent Eclipse Plus C18、Waters Atlantis©T3 C18、太玮JADE-PAK©KP C18，规格均为(250 mm×4.6 mm，5 μm)]和4种不同柱温(20 ℃、25℃、30 ℃和35 ℃)对样品中各成分检测的影响。结果Agilent C18柱在20 ℃、25 ℃、30 ℃，Waters C18柱在20 ℃、25 ℃、30 ℃，太玮C18柱在20 ℃、25 ℃时，各成分与相邻峰均达到基线分离，因此建议柱温设定在20～25 ℃。

4 结语

从含量测定结果来看，15批次金乌骨通胶囊样品中淫羊藿苷含量范围为0.509～1.323 mg/g，平均值为0.720 mg/g；两种补骨脂素总含量的范围为0.930～1.588 mg/g，平均值为1.286 mg/g，以平均值下浮30%确定含量限度，建议本品每1 g含淫羊藿苷不得低于0.50 mg，含两种补骨脂素的总量不得低于0.90 mg，15批次样品测定结果均高于拟定的含量限度。本实验建立的HPLC方法分离效果好，方法耐用，可应用于金乌骨通胶囊的质量控制。