基于网络药理学结合体外实验探讨黑种草治疗糖尿病作用机制

温望文，姚宝乐，朱晓娟，佟天天，白隆博，胡海波，3，刘 海，李林福，黄 浩，，3*

( 1.赣南医学院 药学院 国家中药现代化工程技术研究中心-客家中医药资源研究分中心，江西 赣州 341000；2.澳门科技大学 中药质量研究国家重点实验室，中国 澳门 999078；3.比利时荷语天主教鲁汶大学 生物系，比利时 鲁汶 3000)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一种以糖脂代谢异常为特征，由胰岛素分泌或利用缺陷而引起的慢性代谢性疾病，临床分型为1型糖尿病(Diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(Diabetes mellitus type 2，T2DM)，是临床常见病、多发病[1-2]。据2021年国际糖尿病联盟(IDF Diabetes Atlas)报告显示，全球约有5.37亿成年人患有糖尿病，且每年患病人数仍在持续增加，预计至2045年，患病人数将达7.83亿，2021年，全球糖尿病医疗支出费用高达9 600亿美元[3]，给社会经济带来了沉重负担。糖尿病患者血糖、血脂长期异常会损伤心脏、肾脏、血管和神经等多个组织器官，引发创面愈合障碍、大血管病变、视网膜病变、周围神经病变和心力衰竭等多种严重并发症，具有极高的致死率、致残率，严重威胁患者生命健康[4-6]。糖尿病致病机制复杂，受遗传、心理和环境等多种因素影响[7]。目前，临床治疗DM的药物主要有双胍类(二甲双胍)、磺脲类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类等[8]，但上述药物仅能控制DM病情发展，尚达不到根治疾病的效果，且长期使用易引起各种不良反应，如二甲双胍、阿卡波糖、DPP-4抑制剂等，会引起胃肠道不适、肝肾损伤、身体消瘦等[9-10]，降低患者生活质量，危及患者健康安全。DM为现代医学病名，归属中医学“消渴”范畴。临床研究表明，中药及中药复方可有效治疗DM，能有效控制患者血糖、血脂水平，改善糖尿病并发症，疗效显著、安全性高，具有副作用少、作用温和持久等特点，体现了中医药治疗的优势[11-14]。

黑种草(Nigellasativa)是毛茛科黑种草属的一年生草本植物，常以种子入药，味甘、辛，性温[15]。黑种草富含挥发油、黄酮、皂苷、生物碱和不饱和脂肪酸等多种活性成分[16]，在地中海、中亚和中国新疆等地区有悠久的民族药用历史，被称为“灵丹妙药(Kalonji、A miracle herb)”，可治疗哮喘、偏头痛、癫痫和瘫痪等多种疾病[17-20]。现代药理研究发现，黑种草有显著的抗DM作用，能调节DM患者血糖水平、改善血脂代谢紊乱，抑制糖尿病并发症发生、发展，可明显提高患者生活质量[21-22]。但黑种草化学成分繁多、治疗机制复杂，目前，黑种草治疗DM的药效物质基础和药理机制尚未明确，还有待进一步研究。

网络药理学基于系统生物学理论，通过构建“药物-靶点-疾病”网络，从分子水平研究药效物质基础和药理作用机制，突破了传统“单成分、单靶点”的研究模式，具有系统性、整体性和动态性的特点，与中医药的整体思维和中医辨证论治的整体观思想一致[23-26]。分子对接是计算机辅助药物设计和新药开发的重要技术，通过研究受体蛋白活性位点与配体分子间相互作用，预测结合模式与亲和力，可用于发现或优化药物先导化合物[27-28]。基于此，本研究利用网络药理学方法结合分子对接技术，筛选、验证黑种草治疗DM的主要活性成分，从分子水平阐明药理作用机制，指导后续实验研究，为黑种草治疗DM的临床应用与产品开发提供依据。

1 网络药理学

1.1 化学成分收集与有效成分筛选

通过中药百科全书数据库[29](The encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/)，结合文献调研方法，整理汇总黑种草的化学成分信息，建立黑种草化学成分库。利用PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索收集的黑种草化学成分，获取成分的结构式并以SDF格式导出；对于PubChem数据库中未收录的成分，运用Chemdraw 16.0软件绘制成分结构图并保存为SDF格式。将成分结构的SDF数据导入SwissADME平台[30](http：//www.swissadme.ch/)筛选有效成分。以药代动力学参数(GI absorption)为“High”，类药性参数(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)至少满足2个“Yes”为筛选标准[31]；另结合文献将不符合筛选标准，但明确报道具有药理活性且与研究主题相关的化合物仍列为候选的有效成分。

1.2 有效成分的作用靶标获取与收集

利用中药系统药理学数据库与分析平台[32](Traditional Chinese medicine database and analysis platform，ETCM，https：//tcmsp-e.com/)和SwissTargetPrediction数据库[33](http：//swisstargetprediction.ch/)，对有效成分的作用靶点进行预测，并结合通用蛋白资源数据库(Universal protein resource，Uniprot，https：//www.uniprot.org/)，限定物种为“Human”，将TCMSP数据库获取的蛋白靶点转换为对应的基因名，基因名以官方名称(Offical gene symbol)为标准。汇总基因靶点，删除重复值并剔除无对应靶点的成分，获得黑种草有效成分与基因靶点的有关信息。

1.3 DM疾病基因靶点获取

为保证数据的准确性和完整性，在人类基因数据库(The human genedatabase，GeneCards，https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库[34](Online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)和Uniprot数据库中以关键词“Diabetes mellitus”“Diabetes mellitus type 1”“Diabetes mellitus type 2”分别进行检索，汇总结果并删除重复的基因靶点，即为DM疾病基因靶点库。

1.4 黑种草治疗DM相关基因靶点的获取及韦恩图、蛋白互作图绘制

将“1.2”项下有效成分的基因靶点与“1.3”项下DM疾病基因靶点相互映射，取二者交集即为黑种草治疗DM的相关基因靶点。在Venny 2.1.0在线作图工具平台(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)导入黑种草有效成分的基因靶点及DM疾病基因靶点，获得黑种草治疗DM的基因靶点韦恩图。在STRING数据库(https：//string-db.org/)中导入黑种草治疗DM的相关基因靶点，蛋白种类设置为“Home sapiens”，靶点关联的置信度设置为“High confidengce 0.700”，隐藏游离节点，下载靶点相互作用网络关系的TSV数据，将数据导入Cytoscape 3.8.2软件，绘制成蛋白互作网络(Protein-protein interaction，PPI)，进行数据可视化处理，并使用CytoHubba插件的最大团中心度算法(Maximal clique centrality，MCC)筛选出网络重要的枢纽基因[35]。

1.5 GO生物富集及KEGG信号通路富集分析

采用Metascape数据库[36](http：//metascape.org/)对黑种草治疗DM的相关基因靶点进行基因本体(Gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析，数据库筛选参数PValue Cutoff设定为0.05。下载GO和KEGG通路富集数据，导入imageGP绘图软件，根据-LogP值选出GO生物功能的生物过程(Biological process，BP)、细胞组分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)的前10条和KEGG通路前20条进行数据可视化分析。

1.6 有效成分-疾病靶点-信号通路网络构建

将“1.2”项下黑种草有效成分-基因靶点与“1.3”项获取的DM疾病基因靶点进行匹配，保留有匹配结果的有效成分和基因靶点，删除无匹配结果的数据，结合“1.5”项下富集的糖尿病相关信号通路，获得有效成分-疾病靶点-信号通路数据库。将数据库信息导入Cytoscape 3.8.2软件进行数据可视化处理，预测出黑种草治疗DM的成分与疾病靶点、信号通路的网络关系，并结合Cytoscape内置插件Network Analyzer分析该网络的拓扑学参数，以连接度值(Degree)筛选黑种草治疗糖尿病的核心成分、核心靶点。

1.7 分子对接评估

分析“1.4”项黑种草治疗DM相关靶点PPI网路、“1.6”项下有效成分-DM靶点-信号通路网络，将连接度值较大的核心成分百里醌(Degree：67)、常春藤皂苷元(Degree：60)、羊毛甾醇(Degree：57)、山柰酚(Degree=48)与核心靶点胰岛素蛋白(Insulin，INS)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)，“1.4”项PPI网络中连接度值较大的枢纽靶点芳香化酶(Aromatase，CYP19A1)、皮质类固醇11-β-脱氢酶同工酶1(Corticosteroid 11-beta-dehydrogenase isozyme 1，HSD11B1)、多不饱和脂肪酸5-脂氧合酶(Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase，ALOX5)进行分子对接研究。在RCSB PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)中检索核心靶点蛋白的3D晶体结构，下载靶点蛋白PDB文件，并运用PyMol软件对靶点蛋白进行去除溶剂、加氢、平衡电荷等预处理。通过ZINC数据库[37](https：//zinc.docking.org/)查找核心成分的3D结构，并保存为Mol2格式。在SwissDock数据库[38](http：//www.swissdock.ch/)中导入核心靶点蛋白与核心成分的3D结构，进行分子对接评估分析，评估结果在UCSF Chimera软件[39]中进行可视化处理。

2 细胞实验

2.1 仪器与试剂

旋转蒸发仪RE1010(郑州凯瑞设备有限公司)；BJ-1CD/2CD净化工作台(上海博讯实业有限公司)；实时荧光定量PCR仪QuantStudioTM 5(美国赛默飞公司)；CO2培养箱310(美国赛默飞公司)；酶标仪SpectraMax i3x(美国赛默飞公司)；DSZ2000X倒置显微镜(重庆知微仪器有限公司)。

黑种草(购自北京同仁堂，批号：2110227)；高糖DMEM培养基(H-DMEM，4.5 μg/mL Glu，Sigma-Aldrich公司)；链脲佐菌素(STZ，MCE公司)；qRT-PCR试剂盒(碧云天公司)；Min6胰岛素瘤细胞(凯基生物公司，批号：CL-0674)；胎牛血清(批号：164210)、青霉素-链霉素溶液(批号：PB180120)均购自普诺赛生物公司。

2.2 黑种草提取物制备

取黑种草25 g，按照提取条件为料液比1∶8(g/mL)加入水，温度80 ℃，提取3次，每次30 min。合并3次提取液，滤过，在旋转蒸发仪减压浓缩制成浸膏。取浸膏适量，加PBS制成10 mg·mL-1的黑种草提取物母液，0.22 μm的微孔滤膜滤过，备用。

2.3 细胞培养及糖尿病细胞模型制备

Min6胰岛素瘤细胞加入DMEM培养基(含15%的胎牛血清、50 μg·mL-1链霉素和75 μg·mL-1青霉素)中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养24 h。当细胞融合至70%～80%进行传代。按参考文献[40]方法，将Min6细胞置于含有5 mmol·L-1STZ的DMEM培养基中孵育30 min。即得糖尿病胰岛β细胞模型，命名为糖尿病Min6细胞。

2.4 MTT法检测细胞活力

将正常Min6细胞接种于96孔板中(每孔1.5×105个细胞)，每孔100 μL。试验设置正常组(仅含培养基)，给药组(分别添加培养基和0.30、0.6、1.2、2.4、4.8 mg·mL-1的黑种草提取物)，每组均设置3个重复孔。在37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h后，除去培养基，每孔添加100 μL含有0.5 mg·mL-1MTT的培养基。继续孵育4 h后，吸除培养基，并向每个孔中添加100 μL二甲基亚砜。在酶标仪570 nm波长下测量吸收波长。以正常组细胞存活率为100%，比较给药组细胞活力情况。

2.5 实时定量PCR分析

将Min6细胞接种于6孔板(每孔1.5×105个细胞)中。试验设置正常组：Min6细胞在DMEM中孵育30 min后，置于H-DMEM培养基培养1 h；造模组：糖尿病Min6细胞在添加有5 mmol·L-1STZ的培养基孵育30 min后，置于4.5 mg·mL-1的H-DMEM培养基中孵育1 h；给药组：糖尿病Min6细胞在添加有5 mmol·L-1STZ的培养基孵育30 min，后置于分别添加0.30、0.6、1.2、2.4 mg·mL-1黑种草提取物的H-DMEM培养基中孵育1 h。每组均设有3个重复孔。用Trizol法提取总RNA，取用2 μL总RNA进行反转录获得cDNA。实时PCR检测系统和SYBR对INS、AKT1、ALOX5、AR和ACHE进行RT-PCR扩增，20 μL扩增体系，程序设置为：94 ℃预处理30 s，后进行94 ℃、5 s；62 ℃、34 s；72 ℃、60 s的40个循环。相对表达含量运用2-ΔΔCt法进行计算，将正常组的mRNA表达水平设置为1，研究造模组和给药组相关基因表达的情况。引物序列信息见表1。

表1 引物序列

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 黑种草与DM基因靶点的获取

利用ETCM数据库和SwissADME平台结合文献调研方法，共收集获得黑种草化学成分102个，筛选得到有效成分41个，见表2。通过TCMSP、SwissTargetPrediction数据库预测有效成分潜在的基因靶点，删除重复值，共获得黑种草基因靶点786个。在GeneCards数据库检索DM相关基因靶点共有13 761个，筛选相关度分值(Relevance score)≥10的基因共有806个作为研究靶点；OMIM数据库和Uniprot数据库中分别获得DM相关基因靶点185、184个。汇总去除重复值得到949个DM基因靶点。

表2 黑种草有效成分

续表2

3.2 黑种草治疗DM基因靶点获取及韦恩图、蛋白互作图绘制

将“2.1”项下获取的786个黑种草基因靶点与949个DM基因靶点导入Venny 2.1.0在线作图工具平台制成韦恩图，共获160个交集靶点，即为黑种草治疗DM疾病的基因靶点，见图1。利用String和Cytoscape 3.8.2软件，绘制黑种草治疗DM基因靶点的PPI图，见图2，图中“节点(node)”代表基因靶点，颜色越深、面积越大，说明与网络中更多节点相关联，节点越重要；“边(edge)”代表节点之间的关联强度，边的颜色深浅、宽度代表“Combined score(关联度)”，颜色越深、线条越宽说明连线两端的节点间关系越紧密。运用CytoHubba插件的MCC算法筛选出排名前10的枢纽基因靶点。如图3所示，胰岛素蛋白(Insulin、INS、Degree：121)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase、AKT1、Degree：114)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor、TNF、Degree：112)、清蛋白(Albumin、ALB、Degree：111)、白细胞介素-6(Interleukin-6、IL6、Degree：108)等枢纽基因靶点与网络其他靶点关联紧密，枢纽基因表达上调或下调对整个网络均会造成较大影响。推测图3所示的枢纽基因靶点在黑种草治疗DM时很可能发挥了重要作用。

图1 黑种草治疗DM相关基因靶点韦恩图

图2 黑种草治疗DM相关基因靶点PPI图

图3 黑种草治疗DM相关基因靶点中枢纽基因靶点PPI图

3.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果

将“2.2”项下筛选获得的160个交集靶点上传至Metascape数据库进行GO分析和KEGG通路富集分析。其中，GO分析结果如图4所示，GOBP条目有2 491条，主要涉及糖脂代谢调控、激素分泌、激酶活性调节和炎症反应等方面；GOCC条目有102条，在细胞囊泡、内质网和细胞膜等富集占比高；GOMF198条，相关靶点调节糖尿病的功能主要富集在细胞信号传导活动、转录表达活动和激酶活性调节等。KEGG富集分析共获得通路343条，除去广泛通路[41]，筛选出排名前20的糖尿病相关信号通路，如图5所示。经分析发现，160个黑种草治疗糖尿病相关靶点主要富集在糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、胰岛素抵抗通路(Insulin resistance)和胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)、2型糖尿病通路(Type II diabetes mellitus)、PI3K-Akt通路(PI3K-Akt signaling pathway)和胰高血糖素通路(Glucagon signaling pathway)等糖尿病相关通路上，这表明黑种草作用于多条信号通路发挥抗糖尿病作用。在糖尿病相关通路中，糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路上富集有24个靶点(黑种草治疗DM相关靶点共160个)，富集比最大为15%，可信度最高，可信度值Neglig10_P为31.877；其次为胰岛素抵抗通路，富集基因数为23，可信度值为29.483。此二者可能是黑种草治疗DM的关键通路。

图4 黑种草治疗DM相关基因靶点的GO富集分析图

图5 黑种草治疗DM相关基因靶点KEGG富集分析结果气泡图

3.4 有效成分-疾病靶点-信号通路网络构建

将“2.1”项下黑种草有效成分-作用靶点、DM基因靶点进行匹配，保留有匹配结果的有效成分和作用靶点，删除无匹配结果的数据，结合“2.3”项下富集的糖尿病相关信号通路，获得有效成分-疾病靶点-信号通路数据库，包括39个有效成分、160个疾病靶点和8条糖尿病相关通路。运用Cytoscape 3.8.2软件构建黑种草治疗DM疾病的“有效成分-疾病靶点-信号通路”网络图，并运用Cytoscape内置插件Network Analyzer分析该网络的拓扑学参数。如图6所示，该网络含有213个节点，930条边。节点的颜色越深、面积越大，说明该节点在整个网络中越重要；边的颜色深浅、宽度代表相关度，颜色越深、线条越宽说明连线两端的节点间关系越紧密。网络中Degree(连接度)值排名前10的成分预测为黑种草治疗DM核心成分：百里醌(Degree：67)、常春藤皂苷元(Degree：60)、羊毛甾醇(degree：57)、山柰酚(Degree=48)、β-谷甾醇(Degree=44)、亚油酸(Degree=36)、油酸(Degree=31)、β-香树精(Degree=28)、二聚百里醌(Degree=28)和2，4-二羟基苯乙酸甲酯(Degree=24)；排名前10的核心靶点有：芳香化酶(Aromatase，CYP19A1)、皮质类固醇11-β-脱氢酶同工酶1(Corticosteroid 11-beta-dehydrogenase isozyme 1，HSD11B1)、多不饱和脂肪酸5-脂氧合酶(Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase，ALOX5)、雄激素受体(Androgen receptor，AR)、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，ACHE)、雌激素受体(Estrogen receptor，ESR1)、性激素结合球蛋白(Sex hormone-binding globulin，SHBG)、NPC1样细胞内胆固醇转运蛋白1(NPC1-like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，inducible，NOS2)、类固醇17-α-羟化酶/17α裂解酶(Steroid 17-alpha-hydroxylase/17，20 lyas，CYP17A1)。在Cytoscape网络分析中，每种活性成分对应多个靶点，而每个靶点均连接多个成分。这提示黑种草是通过多成分作用于多靶点发挥治疗DM作用。

3.5 分子对接评估结果

运用SwissDock验证黑种草治疗DM的核心成分与核心靶点、枢纽靶点的结合情况。SwissDock对接结果评价参数主要有Delta G、Cluster rank，Delta G是受体蛋白与配体小分子对接的自由结合能，Delta G为负值代表受体、配体的结合可以自行发生，且Delta G数值≤-7时说明配、受体亲和力强，结合稳定；Cluster rank代表分子不同的结合模式，数值为“0”时，结合模式最佳[42-44]。核心成分与核心靶点、枢纽靶点对接情况如表3所示。挑选Delta G≤-7，配、受体结合稳定的对接组进行可视化处理，如图7所示。枢纽靶点INS-山柰酚、AKT1-山柰酚、TNF-羊毛甾醇、TNF-山柰酚，核心靶点CYP19A1-常春藤皂苷元、CYP19A1-山柰酚、HSD11B1-羊毛甾醇、HSD11B1-山柰酚、ALOX5-羊毛甾醇、ALOX5-山柰酚均结合稳定，有较好的相互作用。这提示核心成分、核心靶点和枢纽靶点可能是黑种草发挥抗DM作用的主要药效成分、作用靶点。

图6 黑种草治疗DM的有效成分-疾病靶点-信号通路网络

表3 核心成分与枢纽、核心靶点的分子对接情况

图7 核心成分与枢纽、核心靶点的分子对接图

3.6 黑种草提取物对Min6细胞活力的影响

通过MTT试验评估黑种草提取物对Min6细胞活力的影响，如图8所示，在0.30、0.60、1.20、2.40 mg·mL-1给药浓度下，细胞存活率均>90%，说明黑种草提取物的上述浓度对细胞影响较小。对比正常组，给药4.8 mg·mL-1黑种草提取物后，细胞存活率显著降低(P<0.001)，说明该浓度对Min6细胞毒性较强，会影响其正常生长，为避免干扰后续试验，不采用此浓度。

注：与正常组比较，***P<0.001。

3.7 黑种草提取物对INS、AKT1、ALOX5、ACHE和AR的mRNA表达影响

黑种草提取物对糖尿病Min6细胞中INS、AKT1、ALOX5、ACHE和AR的mRNA表达影响见图9。与造模组相比，黑种草提取物给药组(0.30、0.6、1.2、2.4 mg·mL-1)的INS、AKT1、ALOX5和AR的mRNA表达均显著提高，ACHE的mRNA表达水平明显下降。

注：与造模组比较，nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4 讨论

糖尿病DM是临床常见、多发的慢性疾病，亦是全球患病人数增长最快的疾病之一[45]，严重威胁人类公共卫生安全。抗糖尿病药物的开发受到医药行业的持续关注，但由于传统抗糖尿病的化学药、生物药存在无法彻底治愈，长期服用易产生耐药性及诸多副作用等问题[46]。近年来，以天然药物为基础的糖尿病治疗策略得以广泛研究，其中，黑种草被认为是极具开发价值的抗糖尿病天然药物[47]。研究表明，黑种草通过多种活性成分协同作用，调节糖尿病患者的高血糖水平，改善血脂谱，缓解糖尿病并发症，从而发挥其抗糖尿病活性[48-49]。但黑种草化学成分复杂，且囿于传统“单成分”“单靶点”的研究模式，黑种草治疗DM的活性成分、作用机制仍未十分明确。本研究利用网络药理学结合分子对接技术，从分子层面研究黑种草抗糖尿病的物质基础、作用机制，为后续实验的开展提供了目标与思路。

通过构建有效成分-疾病靶点-信号通路网络发现，黑种草通过多种活性成分，经多条信号通路协同作用于多个靶点而发挥抗DM作用，其中，百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、亚油酸、油酸、β-香树精、二聚百里醌和丁香酸等10个化合物是黑种草治疗DM的核心成分[50-52]。百里醌是黑种草主要活性成分之一，含量丰富[50]，Alshahrani S等[53]研究发现，百里醌可以显著降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，改善胰岛素抵抗。此外，百里醌还通过介导PI3K/Akt信号通路，减轻氧化应激、炎症反应和细胞凋亡改善心血管功能，起到缓解糖尿病并发症的效果[54-55]。实验证明，山柰酚、β-谷甾醇、亚油酸、油酸、β-香树精等成分与糖尿病及糖尿病并发症病理机制相关[56-60]，而常春藤皂苷元、羊毛甾醇、β-谷甾醇、二聚百里醌和2，4-二羟基苯乙酸甲酯等成分尚无治疗糖尿病相关报道，可能是潜在的抗糖尿病先导化合物或协同作用成分，还有待进一步实验验证。分析黑种草治疗DM相关基因靶点的PPI网络，结合有效成分-疾病靶点-信号通路网络显示，枢纽靶点INS、AKT1、TNF与Degree值排名前3的核心靶点CYP19A1、HSD11B1、ALOX5在黑种草治疗DM时可能发挥重要作用。其中，INS(胰岛素)参与机体糖稳态调节[61]、脂质代谢[62]、神经突触调节[63]和炎症反应[64]等生物过程，而以上过程均与糖尿病及其并发症有关，胰岛素分泌缺陷、胰岛素抵抗是糖尿病的重要致病因素[1，65]；AKT1是胰岛素受体底物蛋白(Insulin receptor substrate，IRS)的下游效应因子，被磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活，AKT1被激活后可通过正反馈调节方式刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，参与调节机体内葡萄糖糖稳态平衡；研究发现，敲除小鼠AKT基因后，小鼠表现为2型糖尿病表型，证明了AKT的3种亚型AKT1/2/3在2型糖尿病的发病中均发挥重要作用[66-67]。2型糖尿病被认为是由氧化应激导致多基因代谢紊乱而引发的代谢性疾病，氧化应激是造成机体胰岛素抵抗，β细胞功能障碍和葡萄糖耐量受损的根本原因；而ALOX5作为氧化应激相关基因受到学术界的广泛关注[68-69]。Schwartzman等[70]敲除小鼠的ALOX5基因发现，小鼠的胰岛素分泌明显减少，空腹血糖水平和脂肪量显著增加，证明ALOX5在调节机体葡萄糖稳态中有重要作用，ALOX5表达异常会促进2型糖尿病的发生与发展[71]，验证了本研究结果的准确性、科学性。分子对接技术分析连接度值(Degree)排名前4的核心成分百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚与关键枢纽靶点、核心靶点的结合情况，结果表明，每一核心成分均能与多个靶点产生相互作用，体现了黑种草多成分、多通路、多靶点治疗DM的特点。

本研究对黑种草治疗DM相关靶点进行了GO生物进程分析和KEGG通路富集分析发现，黑种草主要干预机体细胞糖脂代谢、激素分泌、激酶活性以及机体炎症反应等生物进程。糖尿病患者糖脂代谢紊乱会导致机体血糖过高、血脂谱异常，也是糖尿病动脉粥样硬化等大血管并发症的高危因素[72]；机体内甲状腺激素、生长激素和糖皮质激素等激素异常分泌可诱发糖尿病发作[73-74]；蛋白激酶对于机体葡萄糖稳态具有重要意义，例如，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide-3-kinase，PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)等激酶异常激活时，将导致肥胖、糖尿病及糖尿病的微血管、大血管病变等[75-76]；炎症通路是肥胖、糖尿病和心血管疾病的致病机制之一[77]，血管炎症反应及组织器官的炎症损伤、病变是糖尿病中、后期的主要危害因素，易诱发心脑血管病变、周围神经病变等。KEGG通路富集主要集中在糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗通路、胰岛素通路、2型糖尿病通路、PI3K-Akt通路和胰高血糖素通路等糖尿病相关通路上。糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路与糖尿病及其并发症密切相关，晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end-products，AGEs)作为该通路的起始环节，是由蛋白质、氨基酸和脂类等分子与还原糖发生美拉德反应的产物，而高血糖浓度会促进该反应进行[78]。当机体处于持续高血糖水平时，大量蓄积的AGEs与细胞表面受体RAGE结合，引发级联反应，激活细胞内NADPH氧化酶生成活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，激活PI3K-Akt信号通路、MAPKs通路和NF-κB通路等下游通路，从而促进炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等生物进程，介导糖尿病及并发症的发生发展[79-83]。研究表明，AGEs及其受体(RAGE)在糖尿病及神经病变、认知障碍、肾病、视网膜病变、动脉粥样硬化、微血管病变等糖尿病并发症的发病机制中发挥重要作用，且二者常作为生物标志物用于检测糖尿病及其并发症的病变情况[84-86]。如图10所示，在糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路中，黑种草成分通过作用于AKT1、IL-6、PIK、VCAM1和NOS3等24个靶点，干扰机体细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应和动脉粥样硬化进程，从而发挥抗糖尿病作用。

图10 黑种草治疗DM的AGE-RAGE信号通路

本研究利用网络药理学方法发现，黑种草百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、亚油酸、油酸、β-香树精、二聚百里醌和丁香酸等多个化合物经由糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗通路、胰岛素信号通路、2型糖尿病通路、PI3K-Akt通路和胰高血糖素通路等糖尿病相关通路，协同作用于INS、AKT1、TNF、ALB、IL-6、CYP19A1、HSD11B1、ALOX5、AR、ACHE等多个靶点发挥干预治疗糖尿病的作用，显示黑种草治疗DM是多成分、多通路、多靶点共同作用的结果。本研究利用实时荧光定量PCR技术，检测了黑种草提取物对糖尿病Min6细胞INS、AKT1、ALOX5、AR和ACHE的mRNA表达水平影响，黑种草可以使INS、AKT1、ALOX5、AR表达上调，促进β细胞胰分泌胰岛素，并降低ACHE表达，抑制细胞凋亡进程，进而调控血糖水平，达到治疗糖尿病的效果。本研究结果可为黑种草治疗DM的临床应用与产品开发提供理论参考和实验依据。