基于活性成分含量测定江西德兴覆盆子采收期和种植条件研究

张晓云，付彩群

1.九江市检验检测认证中心，江西 九江 332000；2.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330000

覆盆子收载于《中国药典》2020 年版，为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥未成熟果实。具有益肾固精缩尿、养肝明目之功效，主要用于遗精滑精，遗尿尿频，阳痿早泄，目暗昏花［1］。目前药理学研究和临床使用证实覆盆子活性成分能直接作用于下丘脑-垂体 -性腺轴系统，治疗男性生殖功能疾病。其作用原理可能是通过抗氧化、抗衰老、维持机体活力、调节免疫力、抵抗炎症、调节微量元素等方面改善男性生殖功能［2-9］。2020 年版《中国药典》覆盆子含量检测指标成分为鞣花酸和山柰酚-3-0-芸香糖苷。目前的科学研究已证实覆盆子主要活性物质有多糖类、黄酮类、皂苷类和生物碱等，张恬恬［10］研究表明覆盆子黄酮类活性物质中分离得到主要化合物椴树苷具有显著的抗肿瘤和抗炎活性。本研究建立了高效液相色谱法检测覆盆子中椴树苷的含量，并利用检测活性成分椴树苷的含量高低，来优选德兴覆盆子的最佳采收期和生长条件，能够更有效地提升覆盆子的品质，确保临床用药疗效［11-12］。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 高效液相色谱仪（美国Waters 有限公司，2695 四元泵，2489 紫外检测器，Empower 色谱工作站）；BP211D（Sartorius 公司）电子天平；电热恒温水浴锅。

1.2 试剂

椴树苷对照品（美国BePure 公司，产品批号为B0003436，纯度98.1%）；乙腈（色谱纯），磷酸（国药集团化学试剂有限公司，优级纯），其他试剂均为分析纯；实验用水均为去离子水。

1.3 药材

12 批次采摘时间和不同生长条件的样品，自采于德兴覆盆子GAP 基地内，8 批次不同来源的覆盆子样品采购于各药材市场，经九江市检验检测认证中心副主任中药师盛晓静鉴定为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果实。具体产地及批次见表1。

表1 覆盆子药材产地及批号

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取椴树苷对照品16.51 mg 于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得椴树苷浓度为0.323 9 mg/mL 的对照品母液。

2.2 供试品溶液的制备

分别精密称取编号为S3（过三号筛）的覆盆子粉末1.0 g，置回流瓶中，再精密加入25 mL 70%乙醇，称定重量，置水浴锅上加热回流1 h，放冷，再用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 色谱条件与系统适用性试验

2.3.1 吸收波长以70% 乙醇为参比溶液，在200～500 nm 波长范围内进行扫描，结果椴树苷在208 nm、268 nm、315 nm 处有最大吸收，因208 nm波长处较接近末端吸收，在268 nm 波长处吸收值比315 nm 波长处低，因此选用椴树苷的检测波长为315 nm。紫外吸收光谱图，见图1。

图1 椴树苷紫外吸收光谱图

2.3.2 色谱分析条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长：315 nm；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（29∶71）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；理论塔板数以椴树苷峰计应不小于4 000。对照品和供试品色谱图见图2。

图2 HPLC色谱图：A.椴树苷对照品；B.覆盆子供试品

2.4 线性关系考察

将椴树苷对照品母液，依次稀释成浓度为10.123 µg/mL，20.245 µg/mL，40.491 µg/mL，80.982 µg/mL，129.570 µg/mL，161.96 µg/mL 系列含量，分别进样10 μL，椴树苷进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明椴树苷对照品的进样质量在0.101～1.620 µg 范围内与峰面积存在着良好的线性关系，回归方程Y=24 154.6X+30 420.73；r=0.999 9。

2.5 精密度试验

取同一对照品溶液先后进样五次，每次10 μL，记录峰面积结果，计算椴树苷的峰面积RSD为0.3%，结果表明仪器具备良好的精密度。

2.6 重复性试验

精密称取编号为S3 的覆盆子样本粉末共6 份，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件测定，椴树苷含量RSD 为1.91 %，结果表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取编号为S3 覆盆子同一供试品溶液，放置在室温状态下，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 内各进样1 次，计算7 次试验测得的椴树苷峰面积和保留时间RSD 值。结果显示峰面积RSD 为1.8%，保留时间的RSD 为0.6%，说明供试品在24 h内稳定性良好。

2.8 加标回收率试验

精密称取编号为S3 的覆盆子粉末（已知含量为0.4678 mg/g）0.5 g，共称取6 份，分别精密加入椴树苷对照品工作液（将对照品母液稀释成64.78 µg/mL）5 mL，再分别精密加入70%乙醇溶液20 mL，按“2.2”项下自“称定重量”起同法制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件检测，计算加样后的平均回收率为98.47%，RSD 为0.89%，结果表明该实验方法稳定可靠。具体数据见表2。

表2 覆盆子中椴树苷的加样回收率（n=6）

2.9 样本测定结果

分别精密称取表1 中的覆盆子样本按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件检测，记录峰面积，并计算椴树苷含量，结果见表3。

表3 不同产地及采收条件样品中椴树苷的含量（n=2） %

3 讨论

选取供试品溶液制备方法是比较了加热回流法和超声提取法，加热回流法中椴树苷提出量明显较超声法为高。在明确了加热回流法后，又比较了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、无水乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇八种提取溶液，以70%乙醇对椴树苷溶解度最优。在上述提取方式和提取溶剂已经确定的情况下，考察了不同溶液容量（15 mL、25 mL、50 mL）的提取效率，结果发现溶液体积增加有利于成分溶出，但超过25 mL 后溶出量增加不显著，从节约试剂的角度选择了25 mL 溶液体积。最后考察了提取时限（15 min，30 min，60 min，90 min）对椴树苷提取效率的影响，结果证实，以70%乙醇25 mL，回流提取1 h 覆盆子中椴树苷可基本提取完全。

在流动相选择中，比较了乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液，结果显示流动相采用乙腈-0.1%磷酸溶液不仅柱效高而且分离度好，分析时间短，从而选定乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。在上述色谱条件下比较了Agilent、Waters、Agela 三种C18 色谱柱，三种色谱柱都能较好分离，说明该方法适用性好。椴树苷作为覆盆子中的功效性成分含量高且具有一定专属性，可用于覆盆子质量控制。

根据分析检测结果（表3）可发现，德兴覆盆子青果的椴树苷含量明显高于黄果，表明采收期是影响药材品质的关键因素，故要掌握好覆盆子的采收期，最佳时间为4 月底5 月初，但具体时间应根据当年的气候条件有所调整。背阴条件下栽培的覆盆子青果中椴树苷含量略高于向阳条件下覆盆子青果，两者差异相对较小，应结合其他活性成分和经济效益选择种植条件［13］。同时检测了5 批次浙江产的覆盆子样品，结果显示5 批次椴树苷含量平均值为0.051 0%，与江西产的9 批次覆盆子青果平均值0.049 7%差异不明显。