APP下载

血清NK细胞活化性受体、γ干扰素与非小细胞肺癌患者病情程度、预后的相关性分析*

2022-12-25李艳光宋翔牛洁婷唐国杰

中国现代医学杂志 2022年23期
关键词:期组清液标志物

李艳光,宋翔,牛洁婷,唐国杰

(沧州市中心医院 胸外科,河北 沧州 061000)

非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)在原发性肺癌中最常见,发生率约为80%~85%,其中75%左右的患者确诊时已处于中晚期,预后较差[1]。手术是目前治疗肺癌的主要方式,早期诊断、准确分期是保障疗效的前提。临床至今尚缺乏检测NSCLC 敏感性较高的指标,比较常见的包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、细胞角质蛋白19片 段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1,CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原(sguamous cell carcinoma antigen,SCC-Ag)、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125)等肿瘤标志物[2]。研究[3]发现,机体T 淋巴细胞参与的免疫应答是控制肿瘤生长、杀灭肿瘤细胞的重要途径。γ 干扰素(Interferon γ,IFN-γ)是由CD4+T 淋巴细胞亚群Th1 分泌,能激活效应细胞,提高自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)、巨噬细胞和T 淋巴细胞等活性,通过免疫机制杀伤肿瘤细胞[3]。现代免疫学研究提出,机体处于应激或感染状态下,体内一些细胞受体可产生相关的分子调节免疫功能[4]。NK细胞活化性受体(NKG2D)是对细胞免疫调节最有效的受体之一,广泛表达于NK 细胞、γ 细胞中。有研究指出,NKG2D 可通过免疫应答调节T 细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞,从而影响机体免疫状态[5]。目前国内外针对NKG2D、IFN-γ 与NSCLC 相关性的研究不多。本研究探讨血清NKG2D、IFN-γ水平与NSCLC 患者病情程度、预后的相关性,旨在寻找更有效、准确的预测指标。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究属于前瞻性研究,且获得沧州市中心医院医学伦理委员会审查批准。选取沧州市中心医 院2020 年5 月—2021 年5 月收治 的NSCLC 患者150 例为研究对象,根据TNM 分期标准分为Ⅰ、Ⅱ期组50 例,Ⅲ、Ⅳ期组100 例。Ⅰ、Ⅱ期组男性34 例,女性16 例;年龄39~70 岁,平均(54.69±7.94)岁;病理类型:鳞状细胞癌13 例,腺癌21 例,腺鳞癌16 例。Ⅲ、Ⅳ期组男性71 例,女性29 例;年龄38~72 岁,平均(54.87±8.12)岁;病理类型:鳞状细胞癌27 例,腺癌43 例,腺鳞癌30 例。两组患者临床资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。纳入标准:符合《中华医学会肺癌临床诊疗指南(2018 版)》[6]的诊断标准,并有明确的病理结果;均为原发性肺癌;年龄>18 岁;在初次治疗前有血清指标检测结果;造血功能正常;患者对本研究知情同意并自愿签署知情同意书。排除标准:造血功能异常;心肝肾脏器功能不正常;有严重感染性疾病、免疫系统疾病;有化疗或靶向治疗史。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 FACSC Calibur 型流式细胞仪(美国BD 公司),Centrifuge 5430 高速冷冻离心机、微量移液器(德国Eppendorf 公司),海尔DW-86L288 型(上海领德仪器有限公司),UniCel DxI 800 Access 全自动化学发光免疫分析仪(美国贝克曼库尔特公司)。鼠免疫球蛋白(Immunoglobulin G,lgG)、鼠抗人抗NKG2D PERCP-CY5.5 抗体、鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD8-PE-CY7、鼠抗人CD56-PE、细胞因子刺激剂、细胞固定破膜剂(美国CST 生物科技有限公司),96 孔酶联免疫吸附试验(ELISA)板(美国R&D公司),Ficoll 淋巴细胞分离液(北京Solarbio 化学试剂公司),ELISA 试剂盒(武汉中美科技公司)。

1.2.2 标本采集 取患者入院时的外周静脉血4 mL,3 000 r/min 离心15 min,取上清液分装于1.5 mL 的EP 管中,置入-80℃冰箱冷冻保存待测。

1.2.3 NKG2D检测 取样本加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀移至15 mL 离心管中,加入等体积的Ficoll 淋巴细胞分离液;20℃、2 400 r/min 离心30 min,轻吸单个核细胞层,PBS 液100 r/min 离心10 min,洗涤2 次,弃上清液;用适量PBS 液重悬细胞,混匀注入新离心(EP)管;加入小鼠IgG 10 μg/mL,40℃孵育30 min,排除假阳性;分别加入20 μL 的NKG2D PERCY-CY5.5 抗 体、CD3-FITC、CD56-PE,4℃避光反应30 min,1 000 r/min 离心10 min,弃上清液,PBS 液洗涤2 次,移至流式管;加入4% 0.5 mL 多聚甲醛,采用流式细胞仪检测488 nm 波长处NKG2D水平。

1.2.4 IFN-γ 水平检测 取样本EDTA 抗凝处理,混匀,分装于2 个流式管中,加入30 μL 的外周血、2 μL 的细胞因子刺激剂、1 mL 1640 培养基,混匀,37℃、5%二氧化碳培养箱培养4~6 h;1 500 r/min离心3~5 min,弃上清液;加入100 μL 的1640 培养基重悬细胞;加入适量CD3-FITC、CD8-PE-CY7,4℃避光孵育30 min;再加入500 μL 的1640 培养基,洗涤2 次,1 500 r/min 离心3~5min,弃上清液;加入100 μL 的1640 培养基重悬细胞,再加入细胞固定破膜剂,4℃20 min;加入500 μL 的1×perm/wash buffer 洗涤,1 500 r/min 离心3~5 min,重复2 次,弃上清液;加入500 μL 的1640 培养基重悬细胞。采用流式细胞仪检测IFN-γ 水平。

1.2.5 肿瘤标志物水平检测 采用UniCel DxI 800 Access 全自动化学发光免疫分析仪检测CEA、CA125、CYFRA21-1 水平。

1.2.6 预后情况 采用门诊复查、电话随访等方式,记录患者6 个月内的病死率。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差()表示,比较采用t检验;计数资料以构成比或率(%)表示,比较采用χ2检验;绘制ROC 曲线;相关性分析用Pearson 法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清NKG2D、IFN-γ比较

两组患者血清NKG2D、IFN-γ 比较,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ期组NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期组,IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期组。见表1。

表1 两组患者血清NKG2D、IFN-γ比较()

表1 两组患者血清NKG2D、IFN-γ比较()

2.2 两组患者的肿瘤标志物水平比较

两组患者的血清CEA、CA125、CYFRA21-1 水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ期组CEA、CA125、CYFRA21-1 高于Ⅰ、Ⅱ期组。见表2。

表2 两组患者血清肿瘤标志物水平比较()

表2 两组患者血清肿瘤标志物水平比较()

2.3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ与肿瘤标志物的相关性

Pearson 相关分析显示,血清NKG2D 与CEA(r=-0.683)、CA125(r=-0.615)、CYFRA21-1(r=-0.704)均呈负相关(P<0.05);IFN-γ 与CEA(r=0.512)、CA125(r=0.439)、CYFRA21-1(r=0.543)均呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ与肿瘤标志物的相关性

2.4 不同预后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比较

150 例NSCLC 患者总病死率为22.67%(34/150)。Ⅲ、Ⅳ期组6 个月内病死率为28.00%(28/100),Ⅰ、Ⅱ期组6 个月内病死率为12.00%(6/50),经χ2检验,差异有统计学意义(χ2=4.868,P=0.027)。死亡组与非死亡组血清NKG2D、IFN-γ 比较,经t检验,差异有统计学意义(P<0.05),死亡组NKG2D 低于非死亡组,IFN-γ 高于非死亡组。见表4。

表4 不同预后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比较()

表4 不同预后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比较()

2.5 血清NKG2D、IFN-γ及两者联合对NSCLC患者预后的预测效能

ROC 曲线分析结果显示,IFN-γ、NKG2D 及两者联合预测NSCLC 患者预后的AUC 分别为0.807(95% CI:0.673,0.942)、0.815(95%CI:0.675,0.955)、0.872(95% CI:0.761,0.984),敏感性分别为78.1%(95% CI:0.648,0.892)、82.6%(95% CI:0.713,0.955)、86.5%(95% CI:0.752,0.978),特异性 为51.3%(95% CI:0.443,0.714)、53.6%(95% CI:0.467,0.735)、41.5%(95% CI:0.328,0.616)。见 图1和表5。

图1 血清NKG2D、IFN-γ及两者联合对NSCLC患者预后预测价值的ROC曲线图

表5 血清NKG2D、IFN-γ及两者联合对NSCLC患者预后预测的效能分析

3 讨论

肿瘤细胞是一群生长调控机制失常且可发生恶性转化的自身细胞[7]。T 淋巴细胞是参与免疫应答、抑制肿瘤生长的重要免疫细胞,根据T 细胞受体类型和表面标志可分为CD4+和CD8+两个亚群。CD4+T 细胞主要是通过激活并释放效应细胞,增强清除肿瘤细胞的能力,在抗原特异性免疫过程中,CD4+T 细胞释放的IFN-γ 作用于肿瘤细胞,可诱导多种抗原呈递细胞表达MHC-I 类分子,提高靶细胞对CD8+T 细胞的敏感性,同时还能刺激B 细胞增殖、产生抗体,通过体液免疫途径抑制肿瘤细胞复制[8]。CD4+T 细胞亚群按照分泌的细胞因子与介导的功能不同又分为Th1 和Th2 细胞。Th1 主要分泌IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β),Th2 主要分泌IL-4、IL-6、IL-10,分别具有介导细胞免疫和体液免疫的作用[9]。NSCLC 表面表达的肿瘤抗原被机体免疫系统识别后,可通过以上免疫机制产生免疫应答,攻击并抑制肿瘤生长[10]。

既往国内外研究关于IFN-γ 的研究较多,NK 细胞、NKT 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等均有产生IFN-γ 的能力,此效应细胞能够激活多条信号途径,其中被广泛认知的有JAK-STAT 途径[11]。PAN 等[12]研究显示,IFN-γ-JAK-STAT 信号通路可促进NSCLC 细胞生长和转移。不过IFN-γ 在抗肿瘤免疫调节方面还具有一定争议性。KANAI 等[13]研究指出,非进展期NSCLC 的IFN-γ 水平显著高于进展期NSCLC。本研究结果显示,Ⅲ、Ⅳ期组IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期组,提示血清IFN-γ 水平与NSCLC 患者的分期与病情有关。其原因可能为:①IFN-γ 可通过激活并增强NK 细胞、巨噬细胞、T 细胞等活力,从而调节免疫,增强抗肿瘤能力[14];②IFN-γ 可抑制癌基因表达,延缓肿瘤细胞恶性转化过程;③IFN-γ 可增强TNF 的分泌、加强MHC-II 类抗原的表达、上调TNF 受体进而促进杀伤性T 细胞识别肿瘤细胞[15];④IFN-γ 还可通过负性调控肿瘤相关纤维细胞功能,如纤维细胞中的SMAD 信号通路,抑制成纤维细胞牵拉肿瘤细胞群而导致肿瘤侵袭和转移[16]。

NKG2D 最早被发现是NK 细胞表面主要的激活性受体,随后不断深入研究发现,NKG2D 还广泛表达于γ、δ、T 细胞等绝大多数免疫细胞上,在天然免疫中发挥着重要作用[17]。本研究结果显示,Ⅲ、Ⅳ期组NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期组,NKG2D 异常降低与NSCLC 患者病情有关。张靖悦等[18]研究指出,Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者NKG2D 明显低于Ⅰ、Ⅱ期患者,与本研究结论相似。分析原因为:①NKG2D 可通过固有性免疫应答和适应性免疫应答调节T 细胞、NK 细胞、树突状细胞、巨噬细胞,进以影响机体的免疫功能[19];②NKG2D 可通过与应激细胞表面的配体结合,传递细胞活化信号,激活效应细胞,发挥杀害肿瘤细胞的作用[20];③NKG2D 可与许多配体结合,如NK 细胞与其配体MIC-A 结合,可刺激前者表达NKG2D,发挥对肿瘤的免疫监视作用[21];④NKG2D与配体MIC 可同时刺激CD3+CD4+与CD3+CD8+NKG2 D 细胞增殖,调节免疫。

CEA、CA125、CYFRA21-1 是临床比较常见的肿瘤标志物,通常用于评估肿瘤的疗效及预后判断中。Pearson 相关性显示,以上3 项指标与NKG2D 呈负相关,与IFN-γ 呈正相关,两者对评估NSCLC 患者病情程度具有一定价值。LEE 等[22]研究指出,NSCLC 患者血清IFN-γ 水平较高,可有效预测NSCLC 的无进展生存期。OKITA 等[23]研究显示,NKG2D 配体表达水平可以预测NSCLC 患者的临床病理学特征和预后。本研究ROC 曲线显示,IFN-γ、NKG2D 及两者联合预测NSCLC 患者预后的AUC 分别为0.807、0.815 和0.872,具有较高预测效能。由此可见,检测NKG2D、IFN-γ 能够更好地了解NSCLC的发生发展,为预后提供参考依据。

综上所述,血清NKG2D、IFN-γ 与NSCLC 患者病情程度与肿瘤标志物水平有关,且两者联合检测可有效预测患者早期预后。

猜你喜欢

期组清液标志物
重症流行性出血热患者PBMC 中Fas/FasL 表达及免疫机制研究*
低水平HBsAg患者纤维化分期特征及其与血小板的相关性分析
玉米淀粉制糖发酵生产乳酸主要工艺技术分析
癌胚抗原、糖蛋白抗原联合检测对不同分期胃癌的诊断价值
豆清液不同超滤组分体外抗氧化活性研究
成纤维细胞生长因子-23与慢性肾脏病患者矿物质代谢紊乱的相关性研究
建筑施工废弃泥浆环保型分离技术的研究与探讨
膜技术在木薯淀粉废水深度处理中应用的中试研究
脓毒症早期诊断标志物的回顾及研究进展
冠状动脉疾病的生物学标志物