血清NK细胞活化性受体、γ干扰素与非小细胞肺癌患者病情程度、预后的相关性分析*

李艳光，宋翔，牛洁婷，唐国杰

（沧州市中心医院 胸外科，河北 沧州 061000）

非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）在原发性肺癌中最常见，发生率约为80%～85%，其中75%左右的患者确诊时已处于中晚期，预后较差[1]。手术是目前治疗肺癌的主要方式，早期诊断、准确分期是保障疗效的前提。临床至今尚缺乏检测NSCLC 敏感性较高的指标，比较常见的包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、细胞角质蛋白19片 段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1,CYFRA21-1）、鳞状细胞癌抗原（sguamous cell carcinoma antigen,SCC-Ag）、糖类抗原125（carbohydrate antigen 125,CA125）等肿瘤标志物[2]。研究[3]发现，机体T 淋巴细胞参与的免疫应答是控制肿瘤生长、杀灭肿瘤细胞的重要途径。γ 干扰素（Interferon γ,IFN-γ）是由CD4+T 淋巴细胞亚群Th1 分泌，能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞（natural killer cell,NK cell）、巨噬细胞和T 淋巴细胞等活性，通过免疫机制杀伤肿瘤细胞[3]。现代免疫学研究提出，机体处于应激或感染状态下，体内一些细胞受体可产生相关的分子调节免疫功能[4]。NK细胞活化性受体（NKG2D）是对细胞免疫调节最有效的受体之一，广泛表达于NK 细胞、γ 细胞中。有研究指出，NKG2D 可通过免疫应答调节T 细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞，从而影响机体免疫状态[5]。目前国内外针对NKG2D、IFN-γ 与NSCLC 相关性的研究不多。本研究探讨血清NKG2D、IFN-γ水平与NSCLC 患者病情程度、预后的相关性，旨在寻找更有效、准确的预测指标。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究属于前瞻性研究，且获得沧州市中心医院医学伦理委员会审查批准。选取沧州市中心医 院2020 年5 月—2021 年5 月收治 的NSCLC 患者150 例为研究对象，根据TNM 分期标准分为Ⅰ、Ⅱ期组50 例，Ⅲ、Ⅳ期组100 例。Ⅰ、Ⅱ期组男性34 例，女性16 例；年龄39～70 岁，平均（54.69±7.94）岁；病理类型：鳞状细胞癌13 例，腺癌21 例，腺鳞癌16 例。Ⅲ、Ⅳ期组男性71 例，女性29 例；年龄38～72 岁，平均（54.87±8.12）岁；病理类型：鳞状细胞癌27 例，腺癌43 例，腺鳞癌30 例。两组患者临床资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。纳入标准：符合《中华医学会肺癌临床诊疗指南（2018 版）》[6]的诊断标准，并有明确的病理结果；均为原发性肺癌；年龄>18 岁；在初次治疗前有血清指标检测结果；造血功能正常；患者对本研究知情同意并自愿签署知情同意书。排除标准：造血功能异常；心肝肾脏器功能不正常；有严重感染性疾病、免疫系统疾病；有化疗或靶向治疗史。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 FACSC Calibur 型流式细胞仪（美国BD 公司），Centrifuge 5430 高速冷冻离心机、微量移液器（德国Eppendorf 公司），海尔DW-86L288 型（上海领德仪器有限公司），UniCel DxI 800 Access 全自动化学发光免疫分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。鼠免疫球蛋白（Immunoglobulin G，lgG）、鼠抗人抗NKG2D PERCP-CY5.5 抗体、鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD8-PE-CY7、鼠抗人CD56-PE、细胞因子刺激剂、细胞固定破膜剂（美国CST 生物科技有限公司），96 孔酶联免疫吸附试验（ELISA）板（美国R&D公司），Ficoll 淋巴细胞分离液（北京Solarbio 化学试剂公司），ELISA 试剂盒（武汉中美科技公司）。

1.2.2 标本采集 取患者入院时的外周静脉血4 mL，3 000 r/min 离心15 min，取上清液分装于1.5 mL 的EP 管中，置入-80℃冰箱冷冻保存待测。

1.2.3 NKG2D检测 取样本加入等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）混匀移至15 mL 离心管中，加入等体积的Ficoll 淋巴细胞分离液；20℃、2 400 r/min 离心30 min，轻吸单个核细胞层，PBS 液100 r/min 离心10 min，洗涤2 次，弃上清液；用适量PBS 液重悬细胞，混匀注入新离心（EP）管；加入小鼠IgG 10 μg/mL，40℃孵育30 min，排除假阳性；分别加入20 μL 的NKG2D PERCY-CY5.5 抗 体、CD3-FITC、CD56-PE，4℃避光反应30 min，1 000 r/min 离心10 min，弃上清液，PBS 液洗涤2 次，移至流式管；加入4% 0.5 mL 多聚甲醛，采用流式细胞仪检测488 nm 波长处NKG2D水平。

1.2.4 IFN-γ 水平检测 取样本EDTA 抗凝处理，混匀，分装于2 个流式管中，加入30 μL 的外周血、2 μL 的细胞因子刺激剂、1 mL 1640 培养基，混匀，37℃、5%二氧化碳培养箱培养4～6 h；1 500 r/min离心3～5 min，弃上清液；加入100 μL 的1640 培养基重悬细胞；加入适量CD3-FITC、CD8-PE-CY7，4℃避光孵育30 min；再加入500 μL 的1640 培养基，洗涤2 次，1 500 r/min 离心3～5min，弃上清液；加入100 μL 的1640 培养基重悬细胞，再加入细胞固定破膜剂，4℃20 min；加入500 μL 的1×perm/wash buffer 洗涤，1 500 r/min 离心3～5 min，重复2 次，弃上清液；加入500 μL 的1640 培养基重悬细胞。采用流式细胞仪检测IFN-γ 水平。

1.2.5 肿瘤标志物水平检测 采用UniCel DxI 800 Access 全自动化学发光免疫分析仪检测CEA、CA125、CYFRA21-1 水平。

1.2.6 预后情况 采用门诊复查、电话随访等方式，记录患者6 个月内的病死率。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较采用χ2检验；绘制ROC 曲线；相关性分析用Pearson 法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清NKG2D、IFN-γ比较

两组患者血清NKG2D、IFN-γ 比较，差异有统计学意义（P<0.05），Ⅲ、Ⅳ期组NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期组，IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期组。见表1。

表1 两组患者血清NKG2D、IFN-γ比较（）

表1 两组患者血清NKG2D、IFN-γ比较（）

2.2 两组患者的肿瘤标志物水平比较

两组患者的血清CEA、CA125、CYFRA21-1 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），Ⅲ、Ⅳ期组CEA、CA125、CYFRA21-1 高于Ⅰ、Ⅱ期组。见表2。

表2 两组患者血清肿瘤标志物水平比较（）

表2 两组患者血清肿瘤标志物水平比较（）

2.3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ与肿瘤标志物的相关性

Pearson 相关分析显示，血清NKG2D 与CEA（r=-0.683）、CA125（r=-0.615）、CYFRA21-1（r=-0.704）均呈负相关（P<0.05）；IFN-γ 与CEA（r=0.512）、CA125（r=0.439）、CYFRA21-1（r=0.543）均呈正相关（P<0.05）。见表3。

表3 NSCLC患者血清NKG2D、IFN-γ与肿瘤标志物的相关性

2.4 不同预后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比较

150 例NSCLC 患者总病死率为22.67%（34/150）。Ⅲ、Ⅳ期组6 个月内病死率为28.00%（28/100），Ⅰ、Ⅱ期组6 个月内病死率为12.00%（6/50），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.868，P=0.027）。死亡组与非死亡组血清NKG2D、IFN-γ 比较，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05），死亡组NKG2D 低于非死亡组，IFN-γ 高于非死亡组。见表4。

表4 不同预后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比较（）

表4 不同预后NSCLC患者的血清NKG2D、IFN-γ比较（）

2.5 血清NKG2D、IFN-γ及两者联合对NSCLC患者预后的预测效能

ROC 曲线分析结果显示，IFN-γ、NKG2D 及两者联合预测NSCLC 患者预后的AUC 分别为0.807（95% CI：0.673，0.942）、0.815（95%CI：0.675，0.955）、0.872（95% CI：0.761，0.984），敏感性分别为78.1%（95% CI：0.648，0.892）、82.6%（95% CI：0.713，0.955）、86.5%（95% CI：0.752，0.978），特异性 为51.3%（95% CI：0.443，0.714）、53.6%（95% CI：0.467，0.735）、41.5%（95% CI：0.328，0.616）。见 图1和表5。

图1 血清NKG2D、IFN-γ及两者联合对NSCLC患者预后预测价值的ROC曲线图

表5 血清NKG2D、IFN-γ及两者联合对NSCLC患者预后预测的效能分析

3 讨论

肿瘤细胞是一群生长调控机制失常且可发生恶性转化的自身细胞[7]。T 淋巴细胞是参与免疫应答、抑制肿瘤生长的重要免疫细胞，根据T 细胞受体类型和表面标志可分为CD4+和CD8+两个亚群。CD4+T 细胞主要是通过激活并释放效应细胞，增强清除肿瘤细胞的能力，在抗原特异性免疫过程中，CD4+T 细胞释放的IFN-γ 作用于肿瘤细胞，可诱导多种抗原呈递细胞表达MHC-I 类分子，提高靶细胞对CD8+T 细胞的敏感性，同时还能刺激B 细胞增殖、产生抗体，通过体液免疫途径抑制肿瘤细胞复制[8]。CD4+T 细胞亚群按照分泌的细胞因子与介导的功能不同又分为Th1 和Th2 细胞。Th1 主要分泌IFN-γ、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β），Th2 主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，分别具有介导细胞免疫和体液免疫的作用[9]。NSCLC 表面表达的肿瘤抗原被机体免疫系统识别后，可通过以上免疫机制产生免疫应答，攻击并抑制肿瘤生长[10]。

既往国内外研究关于IFN-γ 的研究较多，NK 细胞、NKT 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等均有产生IFN-γ 的能力，此效应细胞能够激活多条信号途径，其中被广泛认知的有JAK-STAT 途径[11]。PAN 等[12]研究显示，IFN-γ-JAK-STAT 信号通路可促进NSCLC 细胞生长和转移。不过IFN-γ 在抗肿瘤免疫调节方面还具有一定争议性。KANAI 等[13]研究指出，非进展期NSCLC 的IFN-γ 水平显著高于进展期NSCLC。本研究结果显示，Ⅲ、Ⅳ期组IFN-γ 水平高于Ⅰ、Ⅱ期组，提示血清IFN-γ 水平与NSCLC 患者的分期与病情有关。其原因可能为：①IFN-γ 可通过激活并增强NK 细胞、巨噬细胞、T 细胞等活力，从而调节免疫，增强抗肿瘤能力[14]；②IFN-γ 可抑制癌基因表达，延缓肿瘤细胞恶性转化过程；③IFN-γ 可增强TNF 的分泌、加强MHC-II 类抗原的表达、上调TNF 受体进而促进杀伤性T 细胞识别肿瘤细胞[15]；④IFN-γ 还可通过负性调控肿瘤相关纤维细胞功能，如纤维细胞中的SMAD 信号通路，抑制成纤维细胞牵拉肿瘤细胞群而导致肿瘤侵袭和转移[16]。

NKG2D 最早被发现是NK 细胞表面主要的激活性受体，随后不断深入研究发现，NKG2D 还广泛表达于γ、δ、T 细胞等绝大多数免疫细胞上，在天然免疫中发挥着重要作用[17]。本研究结果显示，Ⅲ、Ⅳ期组NKG2D 低于Ⅰ、Ⅱ期组，NKG2D 异常降低与NSCLC 患者病情有关。张靖悦等[18]研究指出，Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者NKG2D 明显低于Ⅰ、Ⅱ期患者，与本研究结论相似。分析原因为：①NKG2D 可通过固有性免疫应答和适应性免疫应答调节T 细胞、NK 细胞、树突状细胞、巨噬细胞，进以影响机体的免疫功能[19]；②NKG2D 可通过与应激细胞表面的配体结合，传递细胞活化信号，激活效应细胞，发挥杀害肿瘤细胞的作用[20]；③NKG2D 可与许多配体结合，如NK 细胞与其配体MIC-A 结合，可刺激前者表达NKG2D，发挥对肿瘤的免疫监视作用[21]；④NKG2D与配体MIC 可同时刺激CD3+CD4+与CD3+CD8+NKG2 D 细胞增殖，调节免疫。

CEA、CA125、CYFRA21-1 是临床比较常见的肿瘤标志物，通常用于评估肿瘤的疗效及预后判断中。Pearson 相关性显示，以上3 项指标与NKG2D 呈负相关，与IFN-γ 呈正相关，两者对评估NSCLC 患者病情程度具有一定价值。LEE 等[22]研究指出，NSCLC 患者血清IFN-γ 水平较高，可有效预测NSCLC 的无进展生存期。OKITA 等[23]研究显示，NKG2D 配体表达水平可以预测NSCLC 患者的临床病理学特征和预后。本研究ROC 曲线显示，IFN-γ、NKG2D 及两者联合预测NSCLC 患者预后的AUC 分别为0.807、0.815 和0.872，具有较高预测效能。由此可见，检测NKG2D、IFN-γ 能够更好地了解NSCLC的发生发展，为预后提供参考依据。

综上所述，血清NKG2D、IFN-γ 与NSCLC 患者病情程度与肿瘤标志物水平有关，且两者联合检测可有效预测患者早期预后。