鼻咽癌组织中SP、NK-1R表达与临床病理特征及预后的关系*

邓力强，罗德保

（郴州市第一人民医院 耳鼻咽喉头颈外科，湖南 郴州 423000）

鼻咽癌是发生于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤，多发于中国南部和东南亚国家，男性发病率是女性的2～3 倍[1-2]。鼻咽癌发病隐匿，早期症状隐蔽，肿瘤恶性程度相对较高[3]。目前临床常用的治疗方案包含放疗、化疗、外科手术等，虽然一系列医疗措施提升了鼻咽癌患者生存率，但鼻咽癌患者预后仍不理想，治疗后复发或转移仍是造成鼻咽癌患者死亡的主要原因[4]。

癌细胞的复发或转移是较为复杂的生理病理过程，涉及癌细胞从原发瘤体脱落向周围组织浸润、入侵血管、增殖分化等一系列病理过程。P 物质（substance P,SP）是人体内的速激肽之一，可与其受体神经激肽-1（neurokinin-1 receptor,NK-1R）互相作用而发挥多种作用[5-6]。目前国内外研究[7-9]已证实SP、NK-1R 与恶性肿瘤有关，SP、NK-1R 可抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖、分化、迁移及微血管生成，与乳腺癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤细胞的迁移、浸润关系密切。本研究拟探讨鼻咽癌组织中SP、NK-1R 表达与临床病理特征及预后的关系，期望为鼻咽癌的治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年4 月—2018 年11 月郴州市第一人民医院收治的鼻咽癌患者83 例作为研究组，另选取该院同期行鼻中隔偏曲矫正术患者47 例为对照组。其中，研究组男性61 例，女性22 例；年龄（56.23±6.21）岁。对照组男性27 例，女性20 例；年龄（54.94±6.09）岁。两组的性别构成及年龄比较，差异无统计学意义（χ2=3.533，P=0.060；t=1.146，P=0.254），具有可比性。纳入标准：①研究组符合《SEOM 鼻咽癌治疗临床指南2013》[10]的鼻咽癌的诊断标准，对照组经病理证实鼻咽黏膜组织正常；②研究组首次行鼻咽癌根治性治疗；③研究组既往未接受任何形式治疗；④年龄>18 岁。排除标准：①伴有其他部位恶性肿瘤、严重内科合并症；②重要脏器严重功能障碍、血栓高度风险及存在活动性出血；③伴有免疫缺陷性疾病、传染性疾病、血液系统疾病；④存在沟通障碍；⑤存在治疗禁忌证及癌细胞远处转移者；⑥无法完成本研究者。本研究经医院医学伦理委员会审查批准，患者自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 对照组鼻内镜辅助下行鼻中隔偏曲矫正术，保留正常鼻咽黏膜组织待检。参照《SEOM 鼻咽癌治疗临床指南2013》[10]，根据研究组患者个体情况给予根治性放疗、化疗、外科根治治疗等，保留鼻咽癌组织待检。

1.2.2 研究组鼻咽癌组织、对照组正常鼻咽黏膜组织中SP、NK-1R mRNA 相对表达量测定 利用RNA 提取剂RNAiso Plus（日本TaKaRa 公司）提取鼻咽癌组织、正常鼻咽黏膜组织中总RNA，分光光度计测定总RNA 浓度、纯度，筛选后利用逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）逆转录成cDNA，以cDNA 为模板行PCR 扩增，之后进行实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）（美国ABI 7500 Fast Realtime PCR System PCR 仪）。反应体系为20 μL：基组DNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、PCR 缓冲液10 μL、蒸馏水8 μL。反应程序：95℃预变性2 min，95℃变性12 s，60℃退火32 s，72℃延伸3 min，共38 个循环。GAPDH为内参基因，以Ct 值为基础，2-ΔΔCt法计算鼻咽癌组织、正常鼻咽黏膜组织中SP、NK-1R mRNA 相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.2.3 免疫组织化学法检测研究组鼻咽癌组织和对照组正常鼻咽黏膜组织中SP、NK-1R 蛋白的表达 鼻咽癌组织和正常鼻咽黏膜组织标本多聚甲醛固定、脱水，石蜡包埋、切片，灭活、微波抗原修复、洗涤，添加兔抗人SP、NK-1R 抗体，4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液冲洗，滴加生物素标记山羊抗兔二抗后，室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液冲洗，二氨基联苯显色后，苏木精复染、脱水、封片。染色程度为无色（0 分）、淡棕色（1 分）、棕色（2 分）、棕褐色（3 分）；染色范围<5%为0 分、5%～<25%为1 分、25%～<75%为2 分、≥75%为3 分；计算染色程度与染色范围评分的乘积，0 分者为阴性表达，否则为阳性表达。

1.2.4 随访 研究组患者治疗后以门诊复查、住院治疗、电话等方式随访3 年，1 次/月。参照《鼻咽癌复发、转移诊断专家共识》[11]判断随访期间复发或转移情况，出现复发或转移则终止随访。无病生存是指随访期间无复发或转移情况出现。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较做χ2检验；用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较采用Log rank χ2检验；影响因素的分析采用多因素Cox 比例风险模型。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组SP、NK-1R mRNA相对表达量比较

研究组鼻咽癌组织与对照组正常鼻咽黏膜组织中的SP、NK-1R mRNA 相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05），鼻咽癌组织中SP、NK-1R mRNA 相对表达量高于正常鼻咽黏膜组织。见图1 和表2。

表2 两组SP、NK-1R mRNA相对表达量比较（）

表2 两组SP、NK-1R mRNA相对表达量比较（）

图1 研究组鼻咽癌组织与对照组正常鼻咽黏膜组织中的SP、NK-1R mRNA表达

2.2 研究组鼻咽癌组织和对照组正常鼻咽黏膜组织中SP、NK-1R蛋白的表达

研究组鼻咽癌组织和对照组正常鼻咽黏膜组织中SP、NK-1R 蛋白的表达见图2。研究组鼻咽癌组织与对照组正常鼻咽黏膜组织中的SP、NK-1R 蛋白阳性表达率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P<0.05），鼻咽癌组织中SP、NK-1R 蛋白阳性表达率高于正常鼻咽黏膜组织。见表3。

图2 研究组鼻咽癌组织和对照组正常鼻咽黏膜组织中SP、NK-1R蛋白的表达（IHC×200）

表3 鼻咽癌组织和正常鼻咽黏膜组织中SP、NK-1R蛋白阳性表达率的比较 例（%）

2.3 研究组不同临床病理特征患者鼻咽癌组织中SP、NK-1R蛋白阳性表达率的比较

不同性别、年龄、N 分期的研究组患者鼻咽癌组织中SP、NK-1R 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。不同T 分期、M 分期、临床分期的研究组患者鼻咽癌组织中SP 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；研究组T3、T4期患者的鼻咽癌组织中SP 阳性表达率高于T1、T2期患者，研究组M1期患者的鼻咽癌组织中SP 阳性表达率高于M0期患者，Ⅲ～Ⅳa 期的研究组患者鼻咽癌组织中SP 阳性表达率分别高于Ⅰ、Ⅱ期患者。不同M 分期、临床分期的研究组患者鼻咽癌组织中NK-1R 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；研究组M1期患者的鼻咽癌组织中NK-1R 阳性表达率高于M0期患者，研究组Ⅲ～Ⅳa 期患者的鼻咽癌组织中NK-1R 阳性表达率分别高于Ⅰ、Ⅱ期患者。见表4。

表4 研究组不同临床病理特征患者鼻咽癌组织中SP、NK-1R蛋白阳性表达率的比较 例（%）

2.4 影响鼻咽癌患者治疗后复发或转移的因素

83 例鼻咽癌患者截至随访结束时失访8 例（7 例为SP 蛋白阳性表达，1 例为SP 阴性表达；8 例均为NK-1R 蛋白阳性表达）。75 例鼻咽癌患者中10 例（13.33%）出现复发或转移。

单因素分析显示，T 分期、M 分期、临床分期、SP阳性、NK-1R 阳性是影响鼻咽癌患者治疗后复发或转移的因素（P<0.05）。见表5。

表5 影响鼻咽癌患者治疗后复发或转移的单因素分析

以鼻咽癌患者治疗后复发或转移为因变量（未复发或转移=0，复发或转移=1），以T 分期（T1、T2=0，T3、T4=1）、M 分期（M0=0，M1=1）、临床分期（Ⅰ、Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳa=1）、SP 阳性（SP 阴性=0，SP 阳性=1）、NK-1R阳性（NK-1R阴性=0，NK-1R阳性=1）为自变量，纳入多因素Cox 比例风险模型，α入=0.05、α出=0.10，结果显示：M 分 期[R^R=4.958（95% CI：2.040，12.050）]、临床分 期[R^R=6.593（95% CI：2.713，16.023）]、SP 阳性[R^R=4.063（95% CI：1.672，9.875）]、NK-1R 阳 性[R^R=4.047（95% CI：1.665，9.836）]是影响鼻咽癌患者治疗后复发或转移的独立危险因素（P<0.05）。见表6。

表6 影响鼻咽癌患者治疗后复发或转移的Cox多因素分析

2.5 研究组患者鼻咽癌组织中SP、NK-1R蛋白表达与治疗后复发转移的关系

随访3 年，43 例SP 阳性表达患者无病生存34 例，生存率为80.64%；32 例SP 阴性表达患者无病生存31 例，生存率为96.87%；SP 阴性表达与阳性表达患者的生存率比较，经Log rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.453，P=0.035），SP 阴性表达患者的生存率高于阳性表达患者。见图3。

图3 鼻咽癌组织中SP阴性、阳性表达患者的生存曲线图

随访3 年，38 例NK-1R 阳性表达患者无病生存29 例，生存率为78.21%；37 例NK-1R 阴性表达患者无病生存36 例，生存率为97.32%；NK-1R 阳性表达患者与阴性表达患者的生存率比较，经Log rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.451，P=0.011），NK-1R 阴性表达患者的生存率高于阳性表达患者。见图4。

图4 鼻咽癌组织中NK-1R阴性、阳性表达患者的生存曲线图

3 讨论

鼻咽癌属于头颈部恶性肿瘤之一，其发生可能与爱泼斯坦-巴尔病毒感染、遗传、生活环境等多种因素相关[12]。目前国内外已有报道指出SP、NK-1R 在乳腺癌[7]、甲状腺癌[8]等多种癌症中异常高表达。但是目前关于鼻咽癌组织中SP、NK-1R表达特征尚缺乏报道，鼻咽癌组织中SP、NK-1R的表达与患者临床病理特征及预后的关系仍缺乏数据支持。

本研究显示鼻咽癌组织中SP、NK-1R mRNA相对表达量均高于正常鼻咽黏膜组织，鼻咽癌组织中SP、NK-1R 蛋白阳性表达率均高于正常鼻咽黏膜组织，说明SP、NK-1R 在鼻咽癌患者癌组织中异常高表达。M1期、Ⅲ～Ⅳa 期的鼻咽癌患者癌组织中SP、NK-1 蛋白阳性表达率分别高于M0期、Ⅰ、Ⅱ期者，T3、T4期的鼻咽癌患者癌组织中SP阳性表达率高于T1、T2期者，提示SP、NK-1R 不仅与鼻咽癌发生有关，且与鼻咽癌患者病情相关的病理特征也有关，SP、NK-1R 可能与鼻咽癌患者预后关系密切。Cox 回归分析显示M 分期、临床分期、SP 阳性、NK-1R 阳性是影响鼻咽癌患者治疗后复发或转移的危险因素，说明并印证鼻咽癌患者癌组织中SP、NK-1R 的表达是影响鼻咽癌患者预后的因素。SP 作为一种速激肽，可与其受体NK-1R 互相作用发挥多途径生物学功效，SP 与NK-1R 系统能够偶联激活磷脂酶C 及腺苷酸环化酶，合成肌醇三磷酸、二酰甘油、环腺苷磷酸，参与离子通道活性，传导信号至丝裂原活化蛋白激酶，蛋白激酶激活细胞外的细胞外调节蛋白激酶1/2，进而促进恶性肿瘤细胞有丝分裂、合成DNA，促进鼻咽癌细胞增殖、分化、侵袭和转移。GONZÁLEZ-MOLES 等[13]研究指出SP、NK-1R 系统可启动、激活恶性肿瘤发生、发展等生理病理过程的信号通路。SINGH 等[14]研究显示SP 与NK-1R系统可促使抗凋亡因子Akt 信号激活，从而抑制Fas 配体等凋亡因子对肿瘤细胞的影响。张渝等[15]研究指出SP 可诱导鼻咽癌HNE1 细胞增殖、侵袭。

本研究显示，SP 阴性表达的鼻咽癌患者的生存率高于SP 阳性表达者，NK-1R 阴性表达的鼻咽癌患者的生存率也高于NK-1R 阳性表达者，再次印证鼻咽癌患者癌组织SP 及NK-1R 表达与其预后有关。既往研究也指出SP 及NK-1R 在其他恶性肿瘤中的相似作用，JAVID 等[16]报道SP、NK-1R 阳性表达的食管鳞状细胞癌患者的生存期明显短于SP、NK-1R 阴性表达者；AFSHARI 等[17]研究显示SP、NK-1R 阳性表达的结直肠癌患者预后不良的风险更高；周云丽等[18]研究指出SP、NK-1R 表达上调与乳腺癌患者癌细胞浸润、转移呈正相关，与乳腺癌患者预后不良关系紧密。

综上所述，鼻咽癌患者癌组织中SP、NK-1R表达与临床病理特征及预后有关，SP、NK-1R 阳性表达患者治疗后复发转移风险高。本研究样本量较小，随访时间有限，后期将针对不足之处开展多心中、大样本量研究，并延长随访时间进一步佐证本研究结论，并着重分析SP、NK-1R 通路对鼻咽癌细胞增殖、分化、迁移的影响，更深入了解SP、NK-1R 在鼻咽癌中的作用机制。