浓香型大曲与生产环境微生物群落间的溯源性分析

刘英杰，黄 钧，秦 辉，张宿义，董 异，王 超，王小军，周荣清,2,*

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川 成都 610065；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646699；3.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646699）

传统发酵食品不仅生产历史悠久，也是食品及现代生物产业的重要组成部分，且白酒产业与民族生物产业息息相关[1-2]。大曲是传统白酒生产过程中必需的发酵剂、酶制剂与独特的原料，其微生物群落的多样性对基酒的品质和风味影响显著[3]。大曲因原料、过程调控参数不同，主要分为浓、酱、清3种主要类型，在白酒的生产中，赋予其独特工艺和风味特点。这些大曲生产工艺的共同特点是自然接种、生料发酵、控温调湿定向驯化和调控其群落与代谢[4]。类似众多的传统发酵食品生产，栖息在环境中的微生物与大曲群落多样性和演替密切相关[5-6]。大曲坯是天然培养基[3]，原料、生产环境及设施等微生物群落结构与大曲的密切相关[7-9]，且影响大曲发酵过程。如栖息在空气和发酵设施的耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）是清香大曲酒发酵的主要菌源[10-11]，从酿造车间和曲房空气中分离到了产特征风味的功能酵母和产酶细菌[12-13]，大曲生产环境空气中栖息的微生物与大曲细菌群落的变迁关系密切[14-15]。生产环境与大曲间优势菌群相互交换，驱动大曲微生物群落结构的演替[16-18]，营造了独特的微生态，是生产高质量大曲的重要基础。然而，大曲微生物群落来源和形成机制的研究仍然较少，且生产环境与成曲间群落互作关系迄今鲜见报道。

本研究以同企业使用周期差异显著的新老制曲基地及生产的大曲为对象，应用高通量测序技术探讨生产环境（空气、设施）、原料与大曲微生物群落结构特点，通过溯源分析解析其微生物菌群对大曲群落组成的贡献，旨在揭示浓香型大曲微生物群落的来源，为解析大曲群落定向驯化和驱动作用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Fast DNA SPIN基因提取试剂盒 美国MP Biomedicals公司；Q5 DNA高保真聚合酶 美国New England Biolabs公司；琼脂糖、琼脂糖凝胶电泳缓冲液TAE 美国Invitrogen公司；Marker DL2000 日本TaKaRa公司；Agencourt AMPure Beads 美国Beckman Coulter公司；PicoGreen dsDNA检测试剂盒 美国Invitrogen公司。

1.2 仪器与设备

PSW-Y液体撞击式微生物气溶胶采样器 常州普森电子仪器厂；GL-20G-II立式高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器有限公司；Nanodrop ND-1000紫外分光光度计美国Thermo Fisher公司；2720聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪 美国ABI公司；Gel DocTMXR+凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 空气样品的收集和处理

采样时间正值大曲生产，采样地点为石堡湾的泸州老窖制曲生态园区（简称老厂，28°55'22''N、105°28'36''E）和黄舣的泸州老窖制曲中心（简称新厂，28°51'46''N、105°34'14''E），前者使用周期长达25 a，采用机械制曲工艺；后者使用周期仅2 a，过程参数等控制与老厂一致，采用智能化制曲工艺，且将陈曲粉撒在曲房内营造优势微生物的小生境。

环境设施表面参考Du Hai等[9]方法，磷酸盐缓冲液预先润湿的无菌脱脂棉球，均匀涂抹制曲车间地面、制曲机器、制曲工具、运输推车和曲架等环境后，放入50 mL无菌离心管后密封。环境空气采用液体撞击式微生物气溶胶采样器收集于15 mL无菌的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，采样流量控制为12 L/min，采样时间为15 min，然后装入50 mL无菌离心管，于4 ℃保存待处理。随后，0.22 μm硝酸纤维素滤膜真空抽滤，收集富集菌体的滤膜，置于50 mL离心管中，-80 ℃保藏用于DNA的提取、扩增。

在老厂和新厂的曲坯、制曲车间空气及地面、原料、成曲（刚转房的大曲）取平行样，老厂制曲机器、制曲工具、手推车各取3个平行样，新厂陈曲（存放3个月以上）[19]和曲架各取3个平行样。因系多层制曲，老厂和新厂的成曲分别在上、中、下层各取3个平行样，除老厂原料取了两份平行样外，其余样品均为3个平行样，样品标签参见表1。

表1 老厂和新厂样品的名称和标签Table 1 Information about microbial samples from old and new Daqu production bases

1.3.2 DNA的提取和扩增

按照He Guiqiang[4]和Tang Qiuxiang[20]等方法提取总DNA并完成PCR扩增。按照Fast DNA SPIN提取试剂盒供应商提供的操作程序提取各种样品的总DNA，使用Nanodrop ND-1000初检测其浓度和纯度后，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其分子大小和纯度。随后分别按以下条件完成细菌和真菌的PCR扩增：细菌V3-V4区采用通用引物338F/806R，真菌ITS1区采用通用引物ITS5F/ITS1R。PCR扩增体系（25 μL）：5×reaction buffer和5×GC buffer各5 μL，0.25 μL DNA聚合酶（5 U/μL，Q5 High-Fidelity），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），正反引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。细菌PCR参数：98 ℃预热2 min，98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25个循环，最后72 ℃保持5 min。真菌PCR参数：95 ℃预热3 min，95 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环，最后72 ℃保持10 min。PCR扩增产物用Agencourt AMPure Beads纯化，使用PicoGreen dsDNA检测试剂盒定量。

1.3.3 高通量测序和序列分析

PCR纯化产物送至上海派森诺生物科技有限公司，使用MiSeq基因测序试剂盒v3进行2×300 bp双端测序。采用QIIME pipeline对原始序列进行处理，依据Caporaso等[21]方法去除一些低质量序列，包括长度＜150 bp、序列平均质量＜20、单碱基重复数＞8 bp以及模糊的碱基。最后利用UCLUST算法将高质量的序列以97%的序列相似度聚成不同的可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）[22]。随后在Greengenes和UNITE数据库中检索比对这些序列，最后生成OTU表，记录每个样本中各OTU的丰度和分类。

1.4 数据处理

原始数据采用IBM SPSS Statistics 26.0进行单因素方差分析，P＜0.05表示有统计学意义。序列数据分析主要使用QIIME（v1.8.0），使用R软件（v4.0.5）进行聚类分析和非度量多维尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析，并采用贝叶斯算法软件SourceTracker（v1.0）[23]追溯曲坯微生物群落的来源，其他统计分析使用Origin 2021。

2 结果与分析

2.1 生产环境、原料及大曲的微生物群落多样性差异

图1 大曲及其潜在微生物来源的细菌（A、B）和真菌（C、D）α多样性差异Fig. 1 Difference in α-diversity of bacteria (A, B) and fungi (C, D) from Daqu from old and new production bases and its potential microbial sources

所有样品真菌和细菌的有效序列在53 979～103 223和55 328～120 392之间，其高质量序列在47 331～101 111和38 476～107 863之间，稀疏曲线结果表明，测序深度可以表征微生物群落的多样性。各种样品的细菌和真菌α多样性差异如图1所示。

在老厂的曲坯细菌丰富度小于成曲，多样性则略高，原料的α多样性低于成曲。因长期粉尘沉降和富集，制曲车间地面的细菌丰富度和多样性最高，真菌的丰富度亦最高。高温定向驯化的作用降低了成曲的真菌丰富度和多样性。原料的真菌多样性最高，而制曲车间空气的最低。在新厂中，曲坯微生物α多样性与原料相当，发酵后细菌的α多样性增高，真菌则降低。新厂车间空气的α多样性最低，且低于老厂。曲架因反复接触曲坯，细菌和真菌α多样性较高。因老厂使用周期长，空气和环境中的α多样性高于新厂，老厂曲坯的多样性也高于原料和成曲。类似已报道的结果，两个制曲基地的成曲真菌α多样性低于原料及环境等[9,24]。

图2 细菌（A）和真菌（B）的NMDSFig. 2 Bacterial (A) and fungal (B) NMDS

如图2所示，老厂中的曲坯与原料、机器、工具等群落结构相似度高，与制曲车间空气则距离较远。与老厂类似的是，新厂曲坯细菌和真菌群落与原料的距离都很近，而与车间空气、地面等和曲架距离都较远，新厂曲坯群落与环境的差异较老厂大，成曲和经3个月存放的大曲（陈曲）群落结构相似，说明通过撒陈曲粉营造了适合大曲生产的环境。

2.2 生产环境、原料及大曲的微生物群落结构的差异

图3 老厂优势细菌（A）和真菌（B）分布Fig. 3 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from old production base

老厂各种样品中前16个优势细菌属（至少在两个样品中相对丰度＞2%）的结果如图3A所示。与原料聚为一簇的曲坯的优势细菌为Weissella（70.17%）、Pantoea（10.09%）、Leuconostoc（5.79%）和Lactobacillus（3.79%）。与曲坯聚为一亚簇的成曲中除Weissella（49.91%）、Lactobacillus（13.04%）和Leuconostoc（2.28%）是优势细菌外，Staphylococcus（21.64%）、Bacillus（3.29%）和Pediococcus（2.32%）也占优势。如图3B所示，曲坯与除空气外的环境样品聚为一簇，其优势真菌包括Pichia（32.24%）、Hyphopichia（4.89%）、Wickerhamomyces（1.94%）。Thermoascus（46.90%）、Thermomyces（12.35%）、Rhizopus（9.90%）、Hyphopichia（9.30%）以及Aspergillus（8.71%）则是成曲中的优势真菌。车间空气以Phialemoniopsis（97.58%）为主。曲坯中的3种优势真菌并不主要来自原料而可能源于地面、工具和机器等环境设施。

图4 新厂优势细菌（A）和真菌（B）分布Fig. 4 Distribution of dominant bacteria (A) and fungi (B) in Daqu from new production base

新厂各种样品中，前17个不同属的细菌的聚类分析结果如图4A所示。聚为同簇的曲坯、原料、成曲和陈曲中，Weissella和Leuconostoc为优势细菌，但各样品间的丰度差异显著，在曲坯中为98.22%和0.58%、原料中为87.37%和11.36%、成曲中为27.85%和12.55%，而在陈曲中则为47.03%和5.85%。成曲中的Bacillus和Lactobacillus分别增至2.50%和14.60%，Weissella显著降低，而与陈曲聚类为同亚簇。新厂各样品中的优势真菌属如图4B所示。曲坯与原料聚为同亚簇，Pichia（5.29%）、Hyphopichia（0.07%）和Alternaria（0.07%）为优势真菌，原料中检出的Alternaria（5.83%）为优势真菌。成曲和陈曲中的优势真菌则为Thermoascus（44.20%和44.33%）、Thermomyces（31.25%和8.94%）、Pichia（4.55%和37.16%）以及Aspergillus（10.06%和5.67%）。地面和曲架的Aspergillus等丰度较高而聚类为同亚簇，制曲空气仍为Phialemoniopsis（99.31%）占绝对优势。

两个制曲基地中曲坯和成曲检出的优势微生物都是曾报道大曲与白酒发酵的优势功能菌[9,16,25]。这些微生物包括合成多种风味前体物质的Staphylococcus、产多种功能酶的Bacillus[26]及Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Weissella等乳酸菌[27]，发酵初期的窖泥和糟醅中的优势酵母Pichia和Hyphopichia[28]。Pichia可能来源于环境，在白酒发酵中具有关键作用[29]，是乙醇、有机酸和酯类等多种芳香化合物的贡献者[9,30]。而Pantoea和Alternaria在小麦原料中为优势细菌和真菌[8]，Thermoascus和Thermomyces等为高效降解碳水化合物的嗜热真菌[31-32]。此外，环境设施与大曲群落间相互交换，所以在空气和环境设施中也都有检出这些种属。

2.3 大曲微生物群落的溯源性分析

进一步对两厂大曲微生物进行溯源分析，以确定大曲中的微生物来源以及具体菌属的贡献。

老厂的20个样本（不含成曲）检出215个属的细菌和137个属的真菌，样品曲坯设定为Sink，其余样品设为不同Source，SourceTracker结果表明曲坯中细菌属源于原料（49.3%）和制曲工具（40.3%），细菌的未知来源（0.8%）较少，车间空气（0.1%）和地面（0.2%）贡献度最低（图5B）。进一步对曲坯属水平细菌群落溯源分析，结果表明曲坯优势细菌如Weissella、Pantoea、Leuconostoc、Lactobacillus以及Bacillus等都主要来源于原料和制曲工具，而Rothia、Gluconobacter、Escherichia-Shigella和Rhodococcus等主要来源于制曲工具和机器，车间空气和地面对曲坯细菌贡献较低。曲坯中真菌属主要来源于原料（56.1%），其次是制曲工具（16.7%）、制曲机器（5.3%）等环境设施样品，车间空气等其他环境样品对曲坯微生物贡献较少（图5A）。原料可能并未对曲坯的优势真菌有较大贡献。曲坯属水平真菌群落的溯源分析结果表明曲坯优势真菌Hyphopichia和Wickerhamomyces来源于环境设施样品，Alternaria主要来源于原料，而Pichia来源于原料与环境样品，Trichosporon、Rhizopus和Aspergillus主要来源于原料和制曲工具，而车间空气对曲坯真菌贡献较少，主要贡献了Pichia、Kazachstania和Phialemoniopsis。

对于新厂，18个样本（不含成曲）共检出183个属细菌和76个属真菌，陈曲因新厂撒陈曲粉而作为来源样本分析。SourceTracker结果表明新厂曲坯中细菌属主要来源于原料（96.5%），其次是陈曲（2.6%），而车间空气（0.01%）贡献最低（图5C）。新厂曲坯中真菌属主要来源于原料（96.4%），其次是陈曲（3.5%），车间地面等其他环境样品对曲坯真菌贡献较少。与老厂相比，原料贡献度更高，结合前述分析表明撒陈曲粉强化发酵对曲坯细菌和真菌都有所贡献且对后者贡献更大。对属水平真菌和细菌群落进行溯源分析（图5C），结果表明，对于真菌，原料主要为曲坯贡献了Alternaria、Aspergillus、Wickerhamomyces及其他菌属，而陈曲贡献了Thermoascus、Thermomyces、Trichosporon和Mucor等耐高温菌属以及Pichia、Hyphopichia、Candida等酵母菌属。对于细菌，原料主要为曲坯贡献了Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus以及Staphylococcus、Acetobacter等，陈曲主要贡献了Pediococcus和Bacteroides，这些细菌在大曲已检出，也是白酒发酵过程中的重要功能菌[9,16,25]。

环境等对老厂曲坯的贡献度更高，特别是细菌群落。与老厂相比，新厂空气和环境对曲坯微生物的贡献度很小，且原料对新厂曲坯的贡献更高，新厂可能由于新建其曲坯群落与环境的差异较老厂大。由此可见，生产环境在浓香型大曲的制造过程中起到关键作用，同时通过撒陈曲粉的强化方式可快速营造适合大曲生产的环境。

图5 老厂和新厂不同来源微生物对曲坯的平均贡献率及属水平溯源分析Fig. 5 Average contribution rates of microorganisms from different sources to microbial community in raw starter brick before incubation and genus-level traceability

经过中高温发酵过程，大曲的群落组成发生了显著变化，进一步以相同的制曲环境和原料作为微生物来源，对成曲进行溯源分析，SourceTracker结果显示，制曲环境和原料对老厂成曲细菌群落的贡献度较高，尤其是制曲工具（76.3%），而对真菌群落的贡献度较小且真菌未知来源较多（95.4%），如嗜热真菌属等（图6A），并且新厂成曲细菌和真菌群落主要来源于原料（13.3%和0.6%）和陈曲（40.8%和14.8%），而受环境影响较小，真菌的未知来源仍较多（73.8%）（图6B）。这些结果说明环境对老厂成曲细菌群落的贡献度同样较高，而真菌群落相对稳定，受环境微生物的影响较小，这可能是大曲微生物群落受温、湿度等环境参数调控和驯化所致[33]，尤其是真菌。新厂可能不如老厂环境微生物丰富和稳定，撒陈曲粉强化营造了适合大曲生产的环境，有利于新厂大曲的定向驯化，对维持大曲品质稳定性具有十分重要的作用。

图6 老厂（A）和新厂（B）不同来源微生物对成曲的平均贡献率Fig. 6 Average contribution rates of microorganisms from different sources to mature Daqu from old (A) and new (B) production bases

3 结 论

以同企业的新老制曲基地及生产的大曲为对象，应用高通量测序技术探讨了生产环境（空气、设施）及原料与大曲的群落结构特点，通过溯源分析解析了其微生物菌群对大曲群落组成的贡献。结果表明，在新老两厂，大曲中检出的优势微生物都是白酒发酵过程的重要功能菌，曲坯都以Weissella、Lactobacillus、Leuconostoc等乳酸菌和Pichia、Hyphopichia为主，而成曲中Bacillus、Lactobacillus增加，相应地，Weissella减少，真菌则以Thermoascus和Thermomyces等嗜热真菌为主。生产环境在浓香型大曲的制造过程中起着关键作用。环境设施与大曲微生物群落间相互交换，驱动大曲微生物群落结构的演替，且长期使用的生产环境的群落多样性更高。SourceTracker结果显示，老厂曲坯中微生物主要来源于原料和制曲工具，且老厂环境对曲坯和成曲细菌群落组成的贡献度都更高，但真菌群落相对稳定，受环境微生物的影响较小。新厂曲坯微生物主要来源于原料，陈曲对新厂成曲的微生物贡献高于对曲坯的贡献，通过适当强化方式营造适合大曲生产的环境，可以使生产环境乃至大曲本身朝着有利于大曲品质的方向发展。研究结果揭示了浓香型大曲微生物群落的来源，为解析大曲群落定向驯化和驱动作用提供参考依据。