2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸卤代衍生物的合成及其甜味抑制作用评价

胡涵翠，李加兴，郑建仙,*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640；2.湖南省井矿盐工程技术研究中心，湖南 长沙 410004）

甜味是基本味觉之一，人对糖类存在一种本能的甜味偏好行为，适当的甜味刺激能带来愉悦感[1]。除用作甜味剂外，糖类还具有防腐增色、黏结定型、润滑口感、改善质地、降低凝固点等诸多作用[2]。为满足上述有益特性及必要的营养需求，糖类在一些食品中的添加量往往会偏高，容易造成令人不喜的甜腻口感，如抗疲劳运动饮料及月饼等传统小吃[3-4]。

甜味抑制剂是一类能解决食品口感过甜问题的天然或人工合成化合物，通过与舌头味蕾细胞上的甜味受体结合，以降低甜味受体对甜味物质的感应程度[5-7]。森林匙羹藤酸等植物来源性甜味抑制剂的提取工艺复杂，甜味抑制效果弱，实用价值较低[8]。2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸（2-(4-methoxyphenoxy) propionic acid，HPMP）是一种高效甜味抑制剂，最初从咖啡豆中提取得到，目前已经通过化学合成实现了商业化生产，广泛应用于月饼、糖果、巧克力等高糖食品中[9-11]。据报道，HPMP苯环的疏水性对其甜味抑制活性有积极影响[12]。与HPMP化学结构相似的2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸，也含有2-苯氧基丙酸骨架，其甜味抑制效力比HPMP高约10 倍，可能是因为邻位氯原子增强了其与甜味受体的疏水相互作用[13-14]。因此，可以尝试在HPMP苯环上引入不同的卤原子，以探究卤素取代对HPMP甜味抑制特性的影响。

甜味的准确测定对化合物的甜味抑制效果评价具有重要意义。目前最常用的甜味评价方法主要是感官评价法和电子舌分析法。感官评价法简单迅速，但受主观因素影响较大，易出现味觉疲劳。电子舌是一种智能味觉分析技术，能有效模拟人类味觉评估过程，具有高灵敏度、准确快捷、样品无需预处理等优点，对安全性未知的样品也可适用，在食品、制药等领域应用较多[15-16]。巩效伟等[17]将电子舌响应值与感官评价结果进行关联分析，建立了客观可靠的电子烟甜度评价方法。邓雯婷等[18]证明了电子舌是一种可用于甜味抑制效果评价的有效工具。

本研究通过卤素（F、Cl、Br）取代HPMP苯环的2位或3位的氢原子，设计合成6种HPMP卤代衍生物，并通过核磁共振、红外光谱、高分辨质谱等手段进行结构表征。采用电子舌进行甜味抑制效果评价，考察6种卤代衍生物对蔗糖等多种甜味剂的甜味抑制作用，分析其自身呈味及对甜味剂其他风味的影响，以期为甜味抑制化合物的构效关系研究提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔗糖 太古糖业（中国）有限公司；果糖、葡萄糖、木糖醇、赤藓糖醇 浙江一诺生物科技有限公司；以上甜味剂均为食品级。

2-氟-4-甲氧基苯酚、3-氯-4-甲氧基苯酚 珠海奥博凯生物医药技术有限公司；3-氟-4-甲氧基苯酚上海毕得医药科技股份有限公司；3-溴-4-甲氧基苯酚、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇（色谱纯） 萨恩化学技术（上海）有限公司；2-溴丙酸乙酯 上海麦克林生化科技有限公司；2-氯-4-甲氧基苯酚、2-溴-4-甲氧基苯酚、氢氧化钠、碳酸钾、溴化钾 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、硫酸、乙酸乙酯 广州化学试剂厂；除甲醇外，以上试剂均为分析纯。氘代氯仿（纯度≥99.8%） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

VERTEX 33傅里叶变换红外光谱仪、AVANCE III HD 600M超导核磁共振波谱仪、maXis impact高分辨质谱仪 德国Bruker公司；SA402B味觉分析系统 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 HPMP卤代衍生物的合成

参照Williams等[19]的方法并稍作修改。称取15 mmol相应卤素（F、Cl、Br）取代苯酚、18.8 mmol碳酸钾，溶于25 mLN,N-二甲基甲酰胺，随后加入18.8 mmol 2-溴丙酸乙酯，80 ℃回流搅拌反应13 h。反应结束后，过滤得滤液，加入适量蒸馏水稀释，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机层，50～55 ℃下减压旋蒸。将所得油状液体溶于25 mL乙醇中，加入12 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液，85 ℃下回流反应4 h，减压旋蒸除去乙醇。所得残留物溶于蒸馏水中，滴加3 mol/L硫酸溶液调节至pH 1～2，低温静置，待晶体析出，抽滤后得到粗产物。对粗产物进行重结晶，分离结晶，于50～55 ℃干燥，得到HPMP卤代衍生物，按下式计算产率：

式中：m为实际产量；m0为理论产量。

1.3.2 HPMP卤代衍生物的结构表征

1.3.2.1 红外光谱分析

称量5 mg待测样品，采用溴化钾压片法，在4 000～500 cm-1波数范围内进行傅里叶变换红外光谱扫描。

1.3.2.2 核磁共振波谱分析

称量25 mg待测样品，溶于0.6 mL氘代氯仿，以四甲基硅烷为内标，在室温条件下采集1H-NMR、13C-NMR谱，共振频率分别为600、151 MHz。

1.3.2.3 高分辨质谱分析

称量5 mg待测样品，经甲醇溶解，过0.22 μm滤膜过滤，采用正离子模式进行测试。电喷雾离子源；喷雾器压力0.6 bar；干燥气流速4.0 L/min；干燥气温度180 ℃；毛细管电压3 500 V；扫描范围m/z50～600。

1.3.3 电子舌的味觉测定

SA402B电子舌属于电位型电子舌，采用类脂薄膜作为味觉传感器，当其受到味觉物质刺激，类脂膜一侧的膜电位发生变化，并转换为对应的人味觉信号，最后通过计算机输出为量化味觉值[20-21]。测试前，所有味觉传感器和陶瓷参比电极均需进行预活化：注入200 μL内部液（3.33 mol/L KCl+饱和AgCl溶液）浸没脂膜；GL1甜味传感器浸于专用浸泡液中2 d，CA0酸味传感器、C00苦味传感器、AE1涩味传感器、AAE鲜味传感器、CT0咸味传感器浸于参比溶液（30 mmol/L KCl+0.3 mmol/L酒石酸）中1 d；向参比电极注入内部液至玻璃管顶端5 mm处，用3.33 mol/L KCl溶液浸泡1 d。单独测定甜味指标，每个样品重复测定5次；同时测定其他味觉指标，每个样品重复测定4次。

1.3.4 甜味抑制效果的评价

1.3.4.1 HPMP卤代衍生物对不同质量浓度的蔗糖溶液甜味的影响

分别配制质量浓度4.5、22.5、40 g/100 mL蔗糖溶液，设为低、中、高质量浓度组，然后向每组分别添加质量浓度为200 mg/L的6种卤代衍生物，使用电子舌进行甜味测定并计算甜味抑制率。

1.3.4.2 不同质量浓度的HPMP卤代衍生物对蔗糖溶液甜味的影响

配制质量浓度13.5 g/100 mL蔗糖溶液若干份，分别添加质量浓度50、100、150、200、300 mg/L的HPMP及其卤代衍生物，使用电子舌进行甜味测定并计算甜味抑制率。

1.3.4.3 HPMP卤代衍生物对不同甜味剂甜味的影响

配制质量浓度13 g/100 mL果糖溶液、18.4 g/100 mL葡萄糖溶液、15 g/100 mL木糖醇溶液、15 g/100 mL赤藓糖醇溶液，分别添加质量浓度200 mg/L的HPMP及其卤代衍生物，混匀后，使用电子舌进行甜味测定并计算甜味抑制率。

1.3.4.4 甜味抑制率的计算

式中：I0为甜味物质自身的甜度值；I1为添加了甜味抑制化合物后的甜度值。

1.3.5 HPMP卤代衍生物的自身呈味特征测定

配制质量浓度为200 mg/L的HPMP及其卤代衍生物，采用电子舌测定甜味、酸味、苦味、涩味、鲜味、咸味6种味觉指标。

1.3.6 HPMP卤代衍生物对甜味剂其他味觉的影响

配制质量浓度13.5 g/100 mL蔗糖溶液若干份，分别添加质量浓度200 mg/L的HPMP及其卤代衍生物，采用电子舌测定酸味、苦味、涩味、鲜味、咸味5种味觉指标。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 HPMP卤代衍生物的合成及结构表征

2.1.1 HPMP卤代衍生物的产率

由表1可知，共得到6种HPMP卤代衍生物，其中化合物2-F、3-F、3-Cl和3-Br是未经文献报道的新化合物。6种HPMP卤代衍生物均呈白色晶体状，产率偏低，在20%～46%之间，可用于后续结构表征及甜味抑制作用研究。

表1 6种HPMP卤代衍生物的基本信息Table 1 Basic information of six halogenated derivatives of HPMP

2.1.2 HPMP卤代衍生物的红外光谱分析

如图1所示，由于具有共同的骨架结构，6种HPMP卤代衍生物的红外光谱相似度较高：在3 300～2 500 cm-1波数范围内均有一个明显的宽峰，主要是羧基中O—H和苯环C—H的伸缩振动吸收峰叠加所致；1 730 cm-1波数处为羧基中C＝O的强吸收峰；1 220、1 050 cm-1波数处的吸收峰由Ar—O—C的伸缩振动引起；1 600～1 400 cm-1波数处为苯环骨架的振动吸收峰；850～750 cm-1波数处为苯环三取代产生的特征峰[22]。因此可以表明，6种HPMP卤代衍生物中均存在—COOH、Ar—O—C结构，且为三取代苯环。

图1 6种HPMP卤代衍生物的红外光谱Fig. 1 Infrared spectra of six halogenated derivatives of HPMP

2.1.3 HPMP卤代衍生物的核磁共振分析

通过核磁共振氢谱、碳谱测试，可以确认6种HPMP卤代衍生物均取得了预期结构。经1H NMR确认，6种化合物均含有10个氢原子，比理论值少1个，这是因为羧基氢与溶剂中的活泼氢快速交换，不易出峰。苯环上3个H的化学位移在δ6.58～7.16之间，δ4.68～4.70为与羧基相连的—CH，δ3.76～3.85为甲氧基的—CH3，δ1.64～1.69为与—CH相连的—CH3[23]。13C NMR中，6种HPMP卤代衍生物均含有10种处于不同化学环境中的碳原子，且化学位移值与理论值基本相符。其中，化合物2-F和3-F中由于受到氟原子的强烈作用，与其相连的碳原子被裂分成两重峰[24]。

2.1.4 HPMP卤代衍生物的高分辨质谱分析

如表2所示，离子峰[M+Na]+的计算值与实测值之间的误差均不超过5×10-6，进一步证实6种HPMP卤代衍生物的化学结构。

表2 6种HPMP卤代衍生物的质谱结果Table 2 Mass spectrometric results of six halogenated derivatives of HPMP

2.2 HPMP卤代衍生物对蔗糖甜味的影响

2.2.1 HPMP卤代衍生物对不同质量浓度蔗糖溶液的甜味抑制作用

如图2所示，不同质量浓度的蔗糖溶液中，6种卤代衍生物均能减弱电子舌对蔗糖溶液的甜味响应，这在一定程度上反映了卤素取代对HPMP改良蔗糖甜味的重要性。随着蔗糖溶液的质量浓度升高，6种HPMP卤代衍生物的甜味抑制率均呈现出极显著下降（P＜0.01）的趋势，说明HPMP卤代衍生物可能是通过竞争性抑制减少甜味物质带来的甜味刺激，这与HPMP的甜味抑制机制保持一致[25-26]。此外，各蔗糖质量浓度组中衍生物的甜味抑制率均有：氟取代衍生物＞氯取代衍生物＞溴取代衍生物。由此可知，卤素取代基的种类对HPMP卤代衍生物的甜味抑制作用具有明显影响。卤族元素（F、Cl、Br）随原子序数升高，原子半径依次增加，电负性也相应地减弱。氟原子的电负性极大，原子半径（0.64 Å）最小，C—F键键能较高，可在碳原子周围形成紧密排列，从而产生较强的屏蔽效应[27]，这种特性可能使氟代衍生物表现出比氯代、溴代衍生物更为优异的甜味抑制性能。因此，苯环上卤素取代基的尺寸及电负性大小可能是造成甜味抑制效力差异的关键因素。

图2 HPMP苯环的2位（A）、3位（B）上引入卤素后对不同质量浓度蔗糖溶液的甜味抑制率Fig. 2 Sweetness inhibitory effect of HPMP with halogens introduced at the 2-position (A) or 3-position (B) of the benzene ring on different concentrations of sucrose solution

2.2.2 不同质量浓度的HPMP卤代衍生物对蔗糖溶液的甜味抑制作用

如图3所示，蔗糖溶液质量浓度相同时，HPMP及其卤代衍生物的甜味抑制率均随添加质量浓度的增加而逐渐升高。说明甜味抑制化合物的添加质量浓度对其甜味抑制作用的发挥具有重要影响，进一步验证了HPMP卤代衍生物对甜味的抑制作用类型为竞争性抑制。图3B中，3-F的甜味抑制效果稍优于2-F；质量浓度为50、150 mg/L时3-F、2-F的甜味抑制率稍低于HPMP；质量浓度为200 mg/L时，甜味抑制率：3-F＞2-F＞HPMP；以100、300 mg/L质量浓度添加时，甜味抑制率：3-F＞HPMP＞2-F。图3C中，质量浓度为50 mg/L时，甜味抑制率：3-Cl＞HPMP＞2-Cl；质量浓度达到100 mg/L后，甜味抑制率：HPMP＞2-Cl＞3-Cl。图3D中，3-Br、2-Br的甜味抑制效果无明显比较优势，均弱于HPMP。由此可知，在HPMP苯环的2位或3位上进行卤素修饰，对其甜味抑制作用的影响各不相同。这表明，不同取代位置对卤代衍生物的甜味抑制作用并未表现出明显的结构优势。

图3 不同质量浓度的HPMP（A）及其卤代衍生物（B～D）对蔗糖溶液的甜味抑制率Fig. 3 Sweetness inhibitory effect of HPMP (A) and its halogenated derivatives (B-D) at different mass concentrations on sucrose solution

对HPMP卤代衍生物进行线性回归分析，结果如表3所示，除化合物3-Br外，其余5种卤代衍生物的甜味抑制率与添加质量浓度均存在良好的线性相关性，相关系数均大于0.91。从卤素取代位置来看，相关系数的大小为：2-F＞3-F、2-Br＞3-Br、2-Cl与3-Cl接近。由此可知，在苯环的2位上引入卤素取代基的HPMP衍生物具有明显的效量关系。

表3 HPMP卤代衍生物的线性回归方程Table 3 Dose-effect relationship of halogenated derivatives of HPMP against sweetness

2.3 HPMP卤代衍生物对不同甜味剂甜味的影响

甜味受体由T1R2-T1R3异源二聚体组成，具有较低的特异性，可与多种甜味物质结合，进而产生甜味[28-29]。果糖和葡萄糖可为机体生命活动提供能量，是除蔗糖外较常见的营养型甜味剂[30]。木糖醇和赤藓糖醇是较常见的非营养型甜味剂，在市面上众多无糖食品中均有应用[31]。如图4所示，HPMP卤代衍生物对4种甜味剂均可表现出一定的甜味抑制作用，且抑制程度为：氟取代衍生物＞氯取代衍生物＞溴取代衍生物。

图4A中，HPMP及其卤代衍生物对葡萄糖的甜味抑制效果差异显著（P＜0.05），其甜味抑制率：3-F＞HPMP＞2-F＞2-Cl＞3-Cl＞2-Br＞3-Br；对果糖的甜味抑制率则有：3-F＞HPMP＞2-F＞3-Cl＞2-Cl＞3-Br＞2-Br。图4B中，3-F、2-F对木糖醇和赤藓糖醇甜味的抑制效果均优于HPMP，2-Cl、3-Cl的甜味抑制效果均与HPMP接近，两种溴代衍生物的甜味抑制率最低，且3-Br＞2-Br。上述结果表明，HPMP卤代衍生物的甜味抑制作用范围较为广泛，既能不同程度地减弱营养型甜味剂的甜味，又能抑制非营养型甜味剂的甜味表现。甜味抑制效果也与卤素取代基的种类有关，具有较强电负性的氟、氯取代基能较好地阻止甜味分子与甜味受体结合。同样地，在苯环2位或3位上的卤素取代，均未表现出明显的取代位置优势。由于电子舌对不同类型甜味剂的甜味响应不同[32]，无法直接比较对不同甜味剂的甜味抑制作用。

图4 HPMP及其卤代衍生物对营养型（A）和非营养型（B）甜味剂的甜味抑制率Fig. 4 Sweetness inhibitory effect of HPMP and its halogenated derivatives on nutritive (A) and non-nutritive (B) sweeteners

2.4 HPMP卤代衍生物的其他味觉分析

2.4.1 HPMP卤代衍生物的自身呈味特征分析

如图5所示，HPMP及其卤代衍生物均以酸味、苦味、涩味为主，鲜味、咸味微弱，几乎无甜味。与HPMP相比，6种卤代衍生物的酸味均有所减弱，氟、氯、溴代衍生物的酸味值依次减小；苦味表现则相反，依次为：HPMP＜氟取代衍生物＜氯取代衍生物＜溴取代衍生物，苦味回味强度也呈现出相同规律；HPMP及其卤代衍生物的涩味值则较为接近。说明卤素取代基在HPMP苯环上的引入，会使苦味强度不同程度地提高，这可能与疏水性增强有关系[33]，但对酸味有一定的改善作用。

图5 HPMP及其卤代衍生物基于电子舌的雷达分析图Fig. 5 Radar map of electronic tongue data for HPMP and its halogenated derivatives

2.4.2 HPMP卤代衍生物对甜味剂其他味觉的影响

以蔗糖为例，进一步研究HPMP及其卤代衍生物对甜味剂其他味觉的影响。如图6所示，添加甜味抑制化合物后，蔗糖溶液的酸味、苦涩味均明显增强，鲜味得到抑制，咸味无明显变化。有研究显示，HPMP可能会给食品原有风味带来异味刺激，如引入或加重苦涩味[34]。与HPMP相比，6种卤代衍生物对蔗糖溶液的苦味增强作用出现不同程度地提高，涩味影响差别不大，酸味刺激则更小，这种特性使其可能更适用于有抑甜增苦需求的食品，如巧克力产品，既能消除甜腻口感又可以突出其独特的苦味口感。

图6 含有HPMP及其卤代衍生物的蔗糖溶液的雷达分析图Fig. 6 Radar map of sucrose solution containing HPMP and its halogenated derivatives

3 结 论

通过对HPMP苯环2位和3位的氢原子进行卤素（F、Cl、Br）取代，得到6种HPMP卤代衍生物，并采用1H NMR、13C NMR、红外光谱、高分辨质谱等手段进行结构表征，其中化合物2-F、3-F、3-Cl和3-Br是未经文献报道的新化合物。基于电子舌对HPMP及其卤代衍生物进行甜味抑制效果评价，结果表明，HPMP卤代衍生物可通过竞争性机制发挥甜味抑制作用，甜味抑制率随蔗糖质量浓度升高而极显著下降；作用于同一质量浓度蔗糖溶液时，6种HPMP卤代衍生物的甜味抑制率随添加质量浓度增加而逐渐提高。HPMP卤代衍生物的作用范围较广，对果糖、葡萄糖、木糖醇和赤藓糖醇也有一定效果。对上述甜味剂的甜味抑制率均有：氟取代衍生物＞氯取代衍生物＞溴取代衍生物，说明不同种类卤素取代基的尺寸及电负性大小可能是造成甜味抑制效果差异的关键因素。此外，在苯环的2位上引入卤素的HPMP衍生物均具有明显的量效关系。HPMP卤代衍生物自身风味均以酸、苦、涩味为主，对蔗糖溶液的苦味加重程度相比于HPMP有所提高，但酸味刺激更小，可能更适用于有抑甜增苦需求的产品。本研究表明卤素取代对HPMP的甜味抑制作用具有重要影响，可为甜味抑制化合物的构效关系研究提供一定理论支持，为开发新型甜味抑制剂提供新的思路。