香青兰乙醇提取物对溃疡性结肠炎大鼠AhR/I-κB相关通路蛋白及炎症因子表达的影响*

白文慧 ，彭韵志 ，胡 海，靳 敏 ，陈张军 ，王占黎 ，于 慧

(1.包头医学院研究生院，内蒙古 包头 014040;2.包头医学院基础医学与法医学院;3.内蒙古自治区疾病相关生物标志物重点实验室)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(crohn’s disease，CD)。其中UC主要累及结肠[1]，主要表现为炎症和肠上皮细胞的屏障功能破坏[2-3]。芳香烃受体AhR/I-κB信号通路介导了机体的免疫应答及炎症反应，在UC发生发展中扮演着重要角色[4- 5]。天然药物香青兰乙醇提取物含有丰富黄酮类活性化合物[6]，具有良好的抗炎、抗氧化活性[7-8]。前期研究发现，黄酮类化合物通过与AhR受体结合发挥抗炎作用[9-10]。本研究拟通过硫酸葡聚糖钠盐(dextran sulfate sodium，DSS)建立 UC 大鼠模型，从AhR/I-κB信号通路分析香青兰乙醇提取物治疗UC的分子机制。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 SPF级SD雄性大鼠30只，体质量160～180 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK(蒙)2020-0004。香青兰(中国内蒙古通辽市扎鲁特旗巴彦塔拉村)。硫酸葡聚糖钠盐(DSS)(美国MP Biomedical公司)。水合氯醛、苏木精、伊红(中国北京索莱宝有限公司)。Real-time PCR扩增试剂盒(中国宝日医生物技术有限公司)。引物(中国上海生物工程股份有限公司)。p-I-κB抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2仪器及设备 全自动脱水机(德国Leica 公司，型号：HistoCore PEARL)、石蜡包埋机(德国Leica 公司，型号：HISTOCORE)、石蜡切片机(德国Leica 公司，型号：RM2016)、光学显微镜(德国Leica 公司，型号：471465)， 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司，7500)，梯度PCR仪(美国赛洛捷克公司，SCI1000-G)、冰冻切片机(德国Leica 公司，型号：CM1950)

1.3模型制备及给药 大鼠适应性饲养1周后，按体质量随机分为3组，每组10只，分别为空白组、模型组和香青兰组。除空白组外，其余组给予5 %的DSS饮用。造模时长为7 d。造模结束后，香青兰组灌胃给予400 mg/kg香青兰提取物，空白组和模型组灌胃给予等量生理盐水。给药7 d后，水合氯醛腹腔注射麻醉，取血液和组织标本于-80 ℃保存。

1.4疾病活动指数(disease activity index,DAI) 每日记录各组大鼠的体重、大便性状(正常、松散、腹泻)及便血情况，并根据以上评分计算DAI，DAI评分标准。见表1。

表1 DAI评分标准

1.5HE染色 纵向剖开大鼠结肠，用预冷的生理盐水洗净，截取大鼠结肠溃疡病变部位，放入4 %的多聚甲醛中固定48 h后，将各组大鼠结肠组织常规石蜡包埋、切片，进行常规HE染色，显微镜下进行观察。

1.6实时荧光定量PCR法检测AhR、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表达水平 将结肠组织于液氮中研磨后，按组织 ∶液体=1 ∶10的比例加入Trizol溶液进行裂解，静置5 min，待充分反应后加入氯仿，离心后，分离上层水相至新的离心管中，再加入异丙醇进行萃取，提取总 RNA。参照试剂盒提供的操作步骤，将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模版扩增目的基因。Real-time PCR反应体系为20 μL，包括cDNA模板2 μL，引物对各0.8 μL(10 pmol/μL)，TB Green Premix 10 μL，ROX Reference Dye 0.08 μL ，水6.32 μL。PCR反应条件：预变性(95 ℃，30 s)；扩增过程(95 ℃，5 s；60 ℃，30 s)，循环40次；溶解曲线分析：(95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s)。引物序列见表2。

表2 引物序列

1.7Western blot检测结肠组织中p-I-κB蛋白表达水平 取结肠组织，液氮研磨，按组织 ∶抽提液=1 ∶5的比例加入蛋白抽提液，充分混匀，静置10 min。离心后取上清液。BCA法检测蛋白浓度，蛋白采用10 %十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE)电泳分离后转膜。5 %脱脂奶粉溶液摇床上封闭1 h，封闭后按1 ∶1000的比例加入p-I-κB的一抗，密封4 ℃孵育过夜。孵育一抗后用TBST洗膜5 min，重复清洗3次，之后加入二抗，避光孵育1.5 h，TBST洗膜3次。采用凝胶成像系统进行分析。

1.8免疫荧光检测结肠组织中AhR蛋白表达水平 取结肠组织于4 %多聚甲醛固定2 h，而后转入30 %蔗糖中，室温下脱水48 h，用冰冻切片机取10 μm厚度的结肠组织在0.3 %Triton中破膜10 min，然后进行抗原抗体染色。AhR一抗4 ℃孵育过夜，PBS清洗三次，滴加荧光信号标记的二抗，室温孵育2 h，DAPI染核10 min。采用激光共聚焦拍照观察。

2 结果

2.1香青兰显著降低UC大鼠DAI评分：空白组大鼠毛色光亮，饮食及大便正常。模型组大鼠毛色干枯，进食减少，体重下降，大便次数增多并且伴有血便。香青兰组大鼠的血便、毛色、精神状态逐渐好转，体重也较之前增加。见图1。

图1 各组大鼠DAI评分

2.2香青兰有效缓解UC大鼠结肠黏膜损伤：对照组大鼠结肠黏膜上层完整,杯状细胞形状规则平整，黏膜层无炎性细胞浸润。模型组大鼠黏膜上层破损严重、黏膜下水肿、出血，已无明显的腺细胞形状，黏膜下层大量炎性细胞浸润。香青兰组大鼠黏膜层细胞形状规则，腺体排列整齐，黏膜层基本完整。见图2。

图2 各组大鼠结肠组织病理学变化(HE 染色，×100)

2.3香青兰降低UC大鼠结肠组织炎症因子的转录水平：与空白组比较，模型组IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表达上调，AhR表达下调(P<0.05)；与模型组比较，香青兰组IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表达下调，AhR表达则上调(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠结肠组织 AhR、IL-1β、IL-6和

2.4香青兰降低UC大鼠结肠组织p-I-κB蛋白表达：与空白组比较，模型组大鼠结肠组织p-I-κB蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较，香青兰组大鼠结肠组织、p-I-κB 蛋白表达下调(P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠结肠组织 p-I-κB 蛋白表达水平

2.5香青兰增加UC大鼠结肠组织AhR蛋白表达：与空白组比较，模型组大鼠结肠组织AhR蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组比较，香青兰组大鼠结肠组织AhR蛋白表达上升(P<0.05)。见图5。

图5 各组大鼠结肠组织AhR表达结果(免疫荧光，×40)

3 讨论

溃疡性结肠炎是一类原因不明的慢性炎症疾病。近年来研究重点在于寻找天然药物来代替化学疗法。天然植物香青兰具有抗菌、抗氧化的作用[11]，广泛应用于冠心病、心肌缺血、哮喘等疾病的治疗[12-13]，目前尚无针对溃疡性结肠炎的研究报道。本文拟探讨香青兰通过调节AhR/I-κB通路相关蛋白及炎症因子的表达对溃疡性结肠炎的保护作用。

芳香烃受体(AhR)是一种核转录因子，在无配体时，与热休克蛋白(HSP90)结合，游离在细胞质中，在与配体结合后，进入核内，与芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)结合，促进相关基因的表达[14]。AhR受体在不同的组织或细胞中表达，在炎症反应中发挥的作用也不同。在肠道组织中，肠上皮黏膜屏障是抵御病原体入侵的第一道防线，对于保护肠组织的完整具有重大意义。AhR的缺失不仅影响肠上皮细胞(IECs)的再生和发育[15]，并且会大大减少杯状细胞和黏液的产生。香青兰乙醇提取物富含丰富的黄酮类物质，可以作为AhR受体激动剂，激活AhR,从而降低由DSS诱导的结肠黏膜反应[16]。

NF-κB作为一种核转录因子，正常情况下与其抑制蛋白(I-κB)结合，以无活性方式游离在细胞质中，当发生刺激时，激活信号可激活I-κB激酶 (IKK)，IKK可诱导I-κB发生磷酸化，从而解除I-κB对NF-κB的抑制作用，使 NF-κB进入核内[17]，促进炎症因子的转录。P-I-κB在溃疡性结肠炎模型中高度表达[18]，从而使IL-1B、IL-6、IL-8等炎症因子的表达增加[19- 20]。AhR的激活可以抑制I-κB的磷酸化水平，提示AhR通路对炎症因子转录信号的控制[21- 22]。

本研究结果显示，经香青兰灌胃治疗后，大鼠结肠黏膜层恢复完整，说明香青兰对结肠黏膜有保护作用。与空白组比较，模型组AhR的mRNA水平、蛋白表达水平均降低，p-I-κB蛋白表达升高，IL-1B、IL-6、IL-8 mRNA水平升高。与模型组比较，香青兰组AhR的mRNA水平、蛋白表达水平均升高，p-I-κB蛋白表达降低， IL-1B、IL-6、IL-8 mRNA水平降低。提示香青兰乙醇提取物可作为配体激活AhR，促进AhR基因的转录和表达，降低p-I-κB的磷酸化水平，减少IL-1B 、IL-6、IL-8等炎症因子的转录，达到控制结肠粘膜免疫反应、维护肠黏膜完整的目的，为溃疡性结肠炎的治疗提供了新思路。