基于网络药理学与分子对接探讨紫草素治疗乙型病毒性肝炎的作用机制*

朱 亚，高俊杰，吴 竞,3

(1.皖南医学院第二附属医院检验科,安徽 芜湖 241000；2.蚌埠医学院肿瘤基础研究与临床检验诊断重点实验室；3.皖南医学院临床检验诊断学教研室)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B)感染是全球范围内最常见的病毒感染。据统计全球已有20亿人受到过乙肝病毒感染，其中慢性乙肝病毒携带者多达3.5亿人[1]。近年来病毒药物的出现使得乙肝的功能性治愈成为可能，但是伴随而来的耐药以及不良反应限制了乙肝治疗的进一步发展。

紫草素是从天然植物宗阜根中所提取的紫红色萘醌类色素，主要成分是紫草醌及其衍生物。近年来研究人员发现紫草素可以通过抑制氧化应激和上调Nrf2的表达来减轻由对乙酰氨基酚所引起的急性肝损伤和肝毒性[2,3]，通过激活PI3K/Akt途径来减轻肝脏缺血/再灌注损伤[4]，通过PAF-MAPK轴诱导细胞凋亡和抑制自噬来降低肝纤维化[5,6]并影响丙酮酸激酶M2、HIF1α以及miR-106b/SMAD7/TGF信号轴来调节肝细胞癌的进展[7-9]。以上研究表明，紫草素在肝脏疾病的治疗中可以发挥巨大作用，但其治疗乙型病毒性肝炎的分子机制仍有待探索。

本研究利用网络药理学的研究方法探索紫草素治疗乙型病毒性肝炎的物质基础和药效网络，并利用分子对接技术验证了其主要成分和作用靶点。

1 方法

1.1紫草素有效成分及作用靶点的收集 采用传统中药药理学数据库与分析平台(TCMSP，https：//www.tcmspw.com)、药物与靶标分析网站(PharmMapper，http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)[10]检索紫草素所含的有效化学成分，并获取对应靶点，并利用UniProt数据库(http：//www.uniprot.org)将所有靶标转换为官方基因符号(official gene symbol)。利用Cytoscape 3.8.2软件构建紫草素的作用靶点网络。

1.2乙型病毒性肝炎作用靶点的收集 以“Viral hepatitis B”为关键词分别从在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https：//www.omim.org)、疾病基因关联数据库(DisGeNET，http：//disgenet.org，Dis)[11]、人类基因数据库(GeneCards，https：//www.genecards.org)及毒性与基因比较数据库(CTD，http://ctdbase.org/) 检索收集Viral hepatitis B的人类疾病靶点。

1.3蛋白质相互作用网络的构建 将获得的紫草素的作用靶点及乙型病毒性肝炎的疾病靶点通过Venny2.1进行靶点映射，利用STRING数据库(https：//string-db.org/)获得共同靶点基本数据及其关系数据，利用Cytoscape3.8.2进行PPI网络可视化处理。

1.4富集分析 下载Cluster Profiler R 功能包对紫草素与乙型病毒性肝炎的共同靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集。获得与紫草素治疗乙型病毒性肝炎的密切相关生物学过程 (Biological Process，BP)、细胞组成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)及信号通路。

1.5分子对接 在Uniprot和 RCSB PDB(RCSB protein data bank，https：//www.rcsb.org)中获取靶蛋白的结构文件，Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取主要化合物的三维结构，应用 protein preparation wizard 模块进行蛋白预处理及优化工作；蛋白受体格点文件的创建以结构文件中的配体位置和大小为参考，对于结构文件中不存在活性位点的结构采用sitemap进行探测，选用评分最高的探测位点以完成对接研究。

2 结果

2.1紫草素的有效作用靶点 通过TCMSP数据库和Pharm Mapper数据库检索和筛选并去重后共得到紫草素的有效作用靶点304个，见图1。

图1 紫草素中药-靶点网络图

2.2乙型病毒性肝炎疾病靶点的筛选 在OMIM、GeneCards、DisGeNET和CTD数据库分别检索乙型病毒性肝炎的疾病作用靶点，将作用靶点合并后去除重复靶点最终得到与乙型病毒性肝炎密切相关的人类靶点879个，见图2。

图2 乙型病毒性肝炎疾病靶点网络图

2.3PPI 网络构建 利用Venn图进行靶点映射(图3)，共得到63个紫草素治疗乙型病毒性肝炎的预测靶点，绘制PPI网络图，该网络涉及62个蛋白质节点和586条边，以节点大小及颜色反映靶点的度值大小，边的粗细表示节点间关联分值(combine score)的大小，通过PPI网络可知紫草素治疗乙型病毒性肝炎的关键靶点为AKT1(AKT丝氨酸/苏氨酸激酶 1)、ALB(血清白蛋白)、原癌基因SRC(非受体酪氨酸激酶)、MAPK1(丝裂原活化蛋白激酶1)以及EGFR(表皮生长因子受体)等。见图4。

图3 紫草素-乙型病毒性肝炎Venn图

2.4KEGG 通路富集分析 将获得的预测靶点利用R包完成KEGG分析，共得到79条通路，同时以错误发现率(FDR)<0.05为筛选标准共获得30条通路，通过R包绘制通路富集分析气泡图，由此可预测紫草素治疗乙型病毒性肝炎主要是通过PI3K/Akt信号通路实现。见图5-6。

图4 紫草素-乙型病毒性肝炎的蛋白间相互作用(PPI)网络图

图5 KEGG 通路富集分析

图6 PI3K/Akt信号通路

2.5GO功能富集分析 GO富集分析表明，紫草素治疗乙型病毒性肝炎63个靶点主要涉及1 779个生物学过程，41个细胞组分，108个分子功能，以P<0.05和q=0.05为筛选条件进行富集分析，本研究只展示前十个,见图7。其中生物学过程主要包括化学应激的细胞反应、氧化应激反应、对活性氧的反应、氧化应激的细胞反应、对脂多糖的反应、细胞对活性氧的反应、细胞蛋白质定位的正向调节、蛋白质转运的正向调节、对细菌来源分子的反应以及肌肉细胞增殖。细胞组分主要集中在富含纤胶凝蛋白 1 颗粒体、囊泡腔、细胞膜以及小窝等。分子功能方面，涉及蛋白质酪氨酸激酶活性、蛋白结合、药物结合以及激素受体结合。

图7 生物学过程富集分析

2.6分子对接结果 通过绘制的PPI网络靶点图，本研究筛选出5个核心靶点，将紫草素的活性成分与这5个核心靶点的蛋白进行分子对接验证。得到核心靶点蛋白与紫草素分子对接结果见表1。分子对接时配体和受体的结合能越低，构象就越稳定，发生作用的可能性越大，若结合能<0，表明配体分子均能和受体蛋白自发地结合，结合能<-5.0 kJ/moL，表明其结合性好。表1中的化合物均能与靶点蛋白较好地结合。其中紫草素与AKT1结合性最好，见图8。

表1 紫草素分子对接分数

图8 紫草素与AKT1分子对接模式图

3 讨论

我国是一个传统的中医药国家，上千年前中国人就开始使用中药来治病疗伤。因为中药具有很多的活性成分，可以通过许多途径以及不同的靶点发挥协同作用，在治疗复杂疾病中可以发挥巨大的作用。从《神农本草经》可知，紫草属于清热凉血药，含有萘醌、苯醌、生物碱类等活性成分，具有抗病毒抗氧化等作用。目前，抗病毒药物是治疗乙肝的主要手段，但是抗病毒药物容易出现副作用大以及耐药性的问题，所以开发可用的中药对乙肝的治疗意义重大。本研究通过TCMSP和Pharm Mapper数据库筛选紫草素的有效作用靶点，与乙型病毒性肝炎的疾病靶点进行对接，构建了药物-靶点-疾病网络，共得到63个共同作用靶点以及多条信号通路，对紫草素治疗乙型病毒性肝炎的分子机制进行了初步探索。

通过PPI网络筛选出了5个紫草素治疗乙型病毒性肝炎的核心靶点分别是AKT1、SRC、MAPK1、ALB和EGFR。靶点的主要作用集中在氧化应激反应、对脂多糖的反应及免疫反应等方面，这可能是紫草素治疗乙型病毒性肝炎的潜在重要途径。AKT1(AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶 1)是一种蛋白质编码基因,也称为蛋白激酶B，在调节细胞存活、胰岛素信号、血管生成和肿瘤形成中起关键作用。SRC又称非受体蛋白酪氨酸激酶，在与许多不同类型的细胞受体包括免疫反应受体、整联蛋白和其他黏附受体、受体蛋白酪氨酸激酶、G 蛋白偶联受体以及细胞因子受体结合后被激活。参与控制多种生物活动的信号通路，包括基因转录、免疫反应、细胞黏附、细胞周期进程、细胞凋亡、迁移和转化。EGFR(表皮生长因子受体)可以影响细胞的生长、增殖和分化并可以激活细胞内的大量的激酶通路，进而引导下游的MAPK、AKT等信号通路的磷酸化反应，诱导细胞增殖，影响免疫功能。这些研究表明，紫草素可能是通过调控细胞增殖和转化等过程来发挥治疗乙型病毒性肝炎的作用。

KEGG通路富集分析发现PI3K-Akt信号通路，脂代谢与动脉粥样硬化，凝集素受体信号通路，PD-L1和PD1信号通路与紫草素治疗乙型病毒性肝炎密切相关。其中与PI3K-Akt信号通路关系最为密切。众所周知，PI3K-Akt是经典细胞信号通路，可以在细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、葡萄糖代谢以及DNA损伤与修复中发挥重要作用[12]。相关研究表明，长期的慢性乙型肝炎病毒感染会引起肝硬化和肝癌[13-15]。最新研究发现，紫草素可以发挥抑制肝癌细胞增殖和肝癌细胞凋亡的作用[16]，这表明其具有潜在的抗肝癌的价值。而本项研究中我们发现了紫草素可能是通过PI3K/Akt信号通路来治疗乙型病毒型肝炎，而这项机制很可能在治疗肝癌特别是长期慢性乙型肝炎病毒感染所引起的肝癌中发挥作用。

本研究基于网络药理学系统分析明确了紫草素治疗乙型病毒性肝炎的核心靶点，通过GO富集分析与KEGG通路分析阐释其关键信号通路及分子机制，发现紫草素可以通过PI3K-Akt信号通路改善乙型病毒性肝炎。使用分子对接技术对紫草素与核心靶点的结合进行了验证，本研究可为紫草素治疗乙型病毒性肝炎的临床应用提供理论依据，为后续机制研究提供思路和方法。