多纳非尼抑制胆管癌TFK-1细胞增殖、迁移和侵袭及促进凋亡的机制研究

刘猛，姜玖良，付立跃，李俊俊，朱海涛△

胆管癌（CCA）是最常见的胆道恶性肿瘤，5年生存率低，治疗方法有限［1-2］，主要包括手术、放化疗、肝移植、中医治疗和靶向治疗［3］。因多数CCA患者初诊时已存在局部侵犯或远处转移，失去手术机会，越来越多的研究支持化疗、联合化疗或靶向治疗。研究发现，CCA患者存在表皮生长因子受体（EGFR）、血管内皮生长因子（VEGF）、人表皮生长因子受体2（HER2）、丝裂原活化蛋白激酶（MEK）等多种类型突变［4］。多纳非尼是一种多靶点、多激酶抑制剂类小分子抗肿瘤药物，可抑制多种受体激酶，包括VEGF受体、血小板衍生生长因子（PDGF）受体和Raf激酶等［5］，可用于治疗肝癌［6］、甲状腺癌［7］、结肠癌［8］等多种癌症。Wnt/β-catenin信号通路在细胞增殖和分化等组织正常发育过程中起重要作用［9］，其异常激活与包括CCA在内的多种类型肿瘤发生和进展密切相关［10］。目前，多纳非尼在CCA的研究较为少见。本研究旨在探究多纳非尼对人CCA细胞生物学功能及Wnt/β-catenin信号通路的影响，为临床应用多纳非尼治疗CCA提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料人胆管癌TFK-1细胞株由南方医科大学中心实验室赠送。多纳非尼（苏州泽璟生物制药股份有限公司）；胎牛血清、DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶（以色列Biological Industries公司）；DAPI、二甲基亚砜（索莱宝公司）；4%多聚甲醛、结晶紫染色液、曲拉通X-100、凋亡试剂盒（碧云天公司）；CCK-8试剂（MCE公司）；Transwell小室（美国康宁公司）；Matrigel基质胶（美国BD公司）；Wnt、β-catenin、细胞周期蛋白-D1（Cyclin D1）、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔抗人一抗及羊抗兔二抗均购自于武汉三鹰公司；羊抗兔荧光二抗（广州艾菲生物公司）；倒置显微镜（Carl Zeiss）；酶标仪、CO2细胞培养箱（美国赛默飞世尔科技公司）；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养与分组TFK-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，待细胞密度达到80%左右，加入胰蛋白酶消化后常规传代培养。以二甲基亚砜为溶剂，将多纳非尼配制成2、5及10 μmol/L溶液对细胞进行干预，分别为2、5、10 μmol/L多纳非尼组；对照组加入等量的不含多纳非尼的二甲基亚砜。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖抑制率将TFK-1细胞收集在离心管中，计数后接种于96孔板中，每孔5×103个细胞，细胞贴壁生长后给药干预，48 h后移去培养液，加入CCK-8试剂和DMEM的混合液，避光1 h后酶标仪检测450 nm光密度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

1.2.3 平板克隆实验检测细胞增殖情况多纳非尼处理细胞后，于6孔板中每孔中加入1 500个TFK-1细胞，每3 d更换1次完全培养基，培养10 d后取出。移除旧的培养基，PBS洗2次，用多聚甲醛室温固定25 min，PBS洗2次，结晶紫染色液染30 min，移液器移除结晶紫，PBS洗净，烘箱干燥，拍照记录并用Image J软件计算各组的克隆数。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞计数后按5×105个/孔接种于6孔板中，按照1.2.1将细胞分组处理，培养24 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，800 r/min离心5 min，收集贴壁细胞，制成0.5 mL单细胞悬液，先后加入Annexin V和PI各5 μL，室温下避光染色10 min。然后使用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 迁移实验：取对数生长期的TFK-1细胞，用DMEM培养基稀释使其细胞密度为5×105个/mL，取100 μL细胞悬液加进Transwell小室上室，下室加入800 μL含20%胎牛血清的完全培养基；1 h后用提前配制好的多纳非尼替换下室培养基，放入细胞培养箱培养48 h后取出小室，室温下多聚甲醛固定25 min，0.1%结晶紫溶液染色15 min，洗净后用棉签轻轻拭去上室未迁移的细胞，倒置显微镜下拍照。侵袭实验：把Matrigel胶与无血清DMEM培养基按1∶8比例配制，加入60 μL基质胶铺于上室中，上下晃动，无气泡产生，4℃干燥过夜，于使用前放置于37℃中使基质胶凝固。后续操作同细胞迁移实验。

1.2.6 蛋白质免疫印迹法检测Wnt、β-catenin、Cyclin D1及Bcl-2、Bax蛋白表达 将TFK-1细胞按1.2.1分组处理，用RIPA裂解液冰上裂解15 min后，离心提取上清蛋白，并通过BCA蛋白质定量试剂盒测量浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质样品分离，恒流湿转法将蛋白转至PVDF膜上，转膜后BSA封闭液室温封闭1 h，孵育一抗GAPDH（1∶5 000）、Wnt（1∶1 000）、β-catenin（1∶5 000）、Cyclin D1（1∶5 000）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶5 000）于4℃过夜，PBS漂洗3遍，加入二抗（1∶5 000）常温下孵育1 h，滴加高敏曝光液在成像系统中曝光，用Image J软件对目的蛋白条带进行灰度值分析，计算蛋白相对表达量。

1.2.7 免疫荧光实验检测β-catenin进入细胞核的变化 将TFK-1细胞分别按照对照组和2 μmol/L多纳非尼组处理，制备细胞爬片，待细胞贴壁后取出用4%的多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，0.2%Triton X-100通透5 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加0.5%BSA室温封闭30 min，滴加一抗放入湿盒，4℃孵育过夜后避光孵育荧光二抗1 h，PBS浸洗玻片3次后孵育DAPI 5 min，封片后荧光显微镜拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料用±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多纳非尼对TFK-1细胞增殖能力的影响2、5、10 μmol/L多纳非尼组细胞增殖抑制率（%）分别为3.86±0.73、16.87±1.89和81.12±1.02，组间差异有统计学意义（n=3，F=1 996.000，P＜0.01）。对照组及2、5、10 μmol/L多纳非尼组克隆形成数（个/视野）分别为326.33±11.46、163.33±3.68、46.67±2.87和13.33±1.25，组间差异有统计学意义（n=3，F=1 033.000，P＜0.01），见图1。

2.2 各组TFK-1细胞凋亡水平比较对照组和2、5、10 μmol/L多纳非尼组的细胞凋亡率（%）分别为3.98±0.69、6.41±0.60、13.44±1.26和20.27±2.20。随着多纳非尼浓度升高，细胞凋亡率逐渐升高（n=3，F=59.550，P＜0.05），见图2。

2.3 多纳非尼抑制TFK-1细胞迁移和侵袭随着多纳非尼浓度升高，细胞迁移和侵袭数量逐渐减少（P＜0.05），见图3、表1。

2.4 各组细胞β-catenin通路蛋白及凋亡相关蛋白表达水平的变化随着多纳非尼浓度的升高，Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达均逐渐下降，Bax蛋白表达逐渐增高（P＜0.05），见图4、表2。

2.5 多纳非尼抑制对β-catenin进入细胞核的影响与对照组［（70.67±4.92）个/视野］比较，2 μmol/L多纳非尼组β-catenin进入细胞核的细胞数［（24.67±3.68）个/视野］减少（n=3，t=10.930，P＜0.05），见图5。

3 讨论

肝内CCA早期常无明显症状，直至病灶进展增大引起胆道梗阻造成胆汁淤积、引流不畅等相应症状出现时已是晚期［11］，加之治疗手段有限且疗效并不理想，以致患者的存活率仍处于较低水平［12］。因此，探寻治疗CCA的新型靶向药物并研究其潜在的分子机制具有重要意义。

Fig.1 Colony formation assay results图1各组克隆形成实验结果

Fig.2 The cell apoptosis in four groups of TFK-1 cells detected by flow cytometry图2 4组TFK-1细胞凋亡流式图

Fig.3 Effects of donafenib on migration and invasion of TFK-1 cells(crystal violet staining,×200)图3 4组TFK-1细胞迁移和侵袭能力变化（结晶紫染色，×200）

Tab.1 Comparison of the migration and invasion of TFK-1 cells between the four groups表1各组TFK-1细胞迁移和侵袭数量比较（个/视野，±s）

Tab.1 Comparison of the migration and invasion of TFK-1 cells between the four groups表1各组TFK-1细胞迁移和侵袭数量比较（个/视野，±s）

＊＊P＜0.01，a与对照组比较，b与2 μmol/L多纳非尼组比较，c与5 μmol/L多纳非尼组比较，P＜0.05；表2同。

组别对照组2 μmol/L多纳非尼组5 μmol/L多纳非尼组10 μmol/L多纳非尼组F n3 3 3 3细胞迁移167.67±5.31 77.33±4.50a 40.67±2.87ab 27.67±2.49abc 507.400＊＊细胞侵袭216.67±4.64 116.33±3.40a 33.67±2.49ab 19.33±2.62abc 1 427.000＊＊

多纳非尼是一种口服抗肿瘤药物，可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞增殖，发挥双重抑制、多靶点阻断的抗肿瘤作用［13］。Wnt/β-catenin通路是一个在胚胎发育和成人组织稳态中起关键作用的蛋白质作用网络，包括Wnt、卷曲蛋白（FZD）、β-catenin、低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）5/6、Dsh、酪蛋白激酶Ӏ（CKl）、T细胞因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）和泛素蛋白（Ub）等，β-catenin是Wnt/β-catenin通路的调节中心，胞质中的β-catenin与TCF/LEF结合后进入细胞核成为转录激活剂，最终激活Wnt靶基因，如CMyc、CyclinD1、环氧合酶-2、c-Jun等，Wnt/β-catenin通路失调可导致包括肿瘤在内的各种严重疾病［14］。在正常的肝脏中，Wnt/β-catenin通路大部分是无活性的，但在细胞更新、再生过程中或某些病理状况下（如癌前病变和肿瘤）会被激活［15］。有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的激活在CCA的诱导和进展中起关键作用，在不同类型的恶性胆道肿瘤中，存在不同Wnt配体（包括Wnt2，Wnt3，Wnt5，Wnt7和Wnt10）的上调以及β-catenin蛋白的重新分布［16］。

Fig.4 Expression changes of β-catenin pathway protein and apoptosis related protein after treatment with donafenib detected by Western blot assay图4 Western blot检测多纳非尼作用后β-catenin通路蛋白和凋亡相关蛋白表达变化

Tab.2 Comparison of expression levels of Wnt,β-catenin,Cyclin D1,Bax and Bcl-2 between the four groups表2各组Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Wnt,β-catenin,Cyclin D1,Bax and Bcl-2 between the four groups表2各组Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白表达水平比较 （n=3，±s）

组别对照组2 μmol/L多纳非尼组5 μmol/L多纳非尼组10 μmol/L多纳非尼组F Wnt 0.72±0.05 0.53±0.02a 0.33±0.04ab 0.17±0.04abc 514.400＊＊β-catenin 0.69±0.03 0.46±0.03a 0.34±0.02ab 0.18±0.01abc 438.000＊＊Cyclin D1 0.80±0.04 0.63±0.03a 0.34±0.02ab 0.31±0.02abc 594.300＊＊Bax 0.15±0.03 0.27±0.02a 0.42±0.01ab 0.90±0.03abc 990.800＊＊Bcl-2 0.53±0.02 0.32±0.02a 0.23±0.02ab 0.13±0.03abc 475.000＊＊

Fig.5 Changes in β-catenin entry into the nucleus after treatment with donafenib detected by immunofluorescence assay(immunofluorescence staining,×200)图5免疫荧光检测多纳非尼处理后β-catenin进入细胞核的变化（免疫荧光染色，×200）

维持增殖信号、激活侵袭和迁移是肿瘤的两大生物学能力［17］。本研究表明，多纳非尼在体外抑制了人胆管癌TFK-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，其在细胞内环境的稳定以及多个系统的发育中发挥重要作用，细胞凋亡失调被认为是癌症发展的主要原因之一［18］。本研究发现，随着多纳非尼浓度的升高，人胆管癌TFK-1细胞的凋亡率逐渐升高，同时抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达逐渐降低，促凋亡蛋白Bax表达逐渐升高，提示多纳非尼可促进TFK-1细胞凋亡。有研究表明藤黄酸能够在胆管癌细胞中抑制Wnt/βcatenin信号通路和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用［9］。笔者推测多纳非尼可能通过影响Wnt/β-catenin信号通路在CCA中发挥抗肿瘤作用。本研究显示，多纳非尼抑制了通路蛋白Wnt、β-catenin和Cyclin D1的表达，说明多纳非尼能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化。Wnt/β-catenin信号通路被激活时，Wnt蛋白会结合FZD蛋白与LRP5/6蛋白组成的异源二聚体受体复合物，最终导致β-catenin在胞质中积累并转运到细胞核［19］。本研究显示，多纳非尼能够抑制β-catenin从胞质转运到细胞核，进一步表明多纳非尼能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。

综上所述，多纳非尼可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化抑制人CCA TFK-1细胞的增殖、迁移及侵袭，并促进细胞凋亡，为多纳非尼治疗胆管癌提供一定的理论基础和参考，但多纳非尼影响Wnt/β-catenin信号通路的具体机制仍需进一步探索。此外，多纳非尼在CCA中的作用还需要通过动物实验研究进一步验证。