lncRNA OIP5-AS1调节miR-942-5p/CHEK1轴对脑胶质瘤细胞生物学行为的影响

2022-12-21陈明武王开宇杨波郑诗豪

天津医药 2022年12期

陈明武，王开宇，杨波，郑诗豪

脑胶质瘤是人中枢神经系统常见的恶性肿瘤，具有生长快、侵袭力强、病死率高、致残率高等特点［1］。尽管脑胶质瘤的治疗（手术切除、放疗、化疗等）取得了很大进展，但病死率和复发率仍较高［2］。因此，加强对脑胶质瘤分子机制的认识，对其诊断和治疗具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在脑胶质瘤中的作用已引起广泛关注［3］。OPA相互作用蛋白5反义转录本1（OPA-interacting protein 5 antisense transcript 1，OIP5-AS1）是一种在包括脑胶质瘤的恶性肿瘤进展中发挥关键作用的lncRNA［4］。据报道，OIP5-AS1在脑胶质瘤组织中上调，与肿瘤的病理分级相关；沉默OIP5-AS1可抑制肿瘤细胞的生长和转移［5-6］。然而，OIP5-AS1在脑胶质瘤中的分子机制尚未阐明。微小RNA（microRNA,miRNA）通过与mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）结合参与多种生物学过程［7］。其中miR-942-5p可在癌症中充当肿瘤启动子或抑制子［8-9］。miR-942-5p在脑胶质瘤中下调，与肿瘤的恶性表型有关［10］。通过生物信息学分析发现，OIP5-AS1和miR-942-5p之间可能存在靶向关系；并且检查点激酶1（checkpoint kinase 1，CHEK1）具有与miR-942-5p结合的位点。CHEK1在脑胶质瘤中上调，与肿瘤的病理分级相关［11］；抑制其表达可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［12-13］。本研究旨在探讨OIP5-AS1在脑胶质瘤发病中的作用以及OIP5-AS1/miR-942-5p/CHEK1轴在肿瘤形成中的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 临床样本收集2019年10月—2021年10月在福建省立医院神经外科33例经病理检查确诊并接受手术切除的胶质瘤患者组织标本。患者术前未接受其他治疗，排除其他恶性肿瘤、严重全身感染及其他严重全身性疾病等并发症。患者年龄25~60岁，平均（46.23±8.50）岁，其中男20例，女13例。根据WHO 2016年公布的中枢神经系统肿瘤病理分类，低级别胶质瘤（Ⅰ/Ⅱ级）14例，包括Ⅰ级6例、Ⅱ级8例，高级别胶质瘤（Ⅲ/Ⅳ级）19例，包括Ⅲ级9例、Ⅳ级10例。非肿瘤性脑组织样本取自33例颅脑损伤成人患者，这些患者接受了部分脑组织切除术以降低颅内压。所有样品都保存在-80℃以供后续试验。所有患者均签署书面知情同意书。实验方案经福建省立医院伦理委员会批准（伦理号：K2019-09-039），符合赫尔辛基宣言。

1.2 细胞人脑胶质瘤细胞系U87、SHG-44、U251和H4均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0238、CL-0207、CL-0237、CL-0087；正常人星形胶质细胞NHA购自合肥万物生物科技有限公司，货号QCLL-101299。所有细胞均在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。

1.3 主要试剂与仪器靶向OIP5-AS1的小分子干扰RNA（siRNA，OIP5-AS1 siRNA，干扰序列：5'-AACCUAAUCAGA⁃CAAGUCCTT-3'）、miR-942-5p mimic（5'-UCUUCUCU⁃GUUUUGGCCAUGUG-3'）和miR-942-5p inhibitor（5'-CA⁃CAUGGCCAAAACAGAGAAGA-3'）及其阴性对照［siRNA NC（5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）、miR-NC（5'-UUU⁃GUACUACACAAAAGUACUG-3'）、inhibitor-NC（5'-CAGUA⁃CUUUUGUGUAGUACAAA-3'）］由上海基因制药有限公司合成。兔源一抗CHEK1（ab32531，Abcam）；人源抗Argonaute2（Ago2）抗体（ab186733，Abcam）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（C0009S，上海碧云天生物技术有限公司）；膜联蛋白V（Annexin-V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒（CA1020，北京Solarbio公司）；双荧光素酶测定试剂盒（E1910，美国Promega公司）；Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（17-700，美国Millipore公司）。ABI Prism®7500型实时荧光定量PCR（qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司）；iMark680多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司）；FACS Calibur流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）；Nikon Eclipse Ti-S倒置显微镜（日本Nikon公司）。OIP5-AS1和CHEK1 3'-UTR的野生型（wt）和突变型（mut）双荧光素酶报告载体委托广州锐博生物技术有限公司构建。

1.4 qPCR检测组织和细胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表达采用TRIzol试剂盒提取组织和细胞的总RNA；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。使用逆转录试剂盒将总RNA（2 μg）逆转录为cDNA。随后，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒扩增cDNA。miR-942-5p以U6为内参基因，OIP5-AS1、CHEK1以GAPDH为内参基因。采用2-ΔΔCt法计算靶基因的相对表达水平。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.5 Western blot检测细胞中CHEK1蛋白表达采用RIPA裂解破坏细胞，并通过用二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定法测定蛋白质浓度。然后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实现蛋白质分离，并将蛋白质转移到PVDF膜上。然后，将膜置于冰箱中，与一抗（CHEK1、GAPDH，稀释比例1︰1 000）在4℃下孵育过夜。之后，加入二抗，室温孵育1 h，然后进行化学发光（ECL）试剂显影，Image J软件分析蛋白条带的灰度值，通过与内参（GAPDH）的灰度比，计算CHEK1蛋白的相对表达。

1.6 细胞分组转染实验分为5组：对照（NC）组（未转染细胞）、siRNA阴性对照（si-NC）组（转染siRNA NC序列的细胞）、OIP5-AS1 siRNA（si-OIP5-AS1）组（转染OIP5-AS1 siRNA的细胞）、si-OIP5-AS1+inhibitor阴性对照（si-OIP5-AS1+anti-NC）组（转染OIP5-AS1 siRNA和inhibitor-NC的细胞）、si-OIP5-AS1+miR-942-5p抑制剂（si-OIP5-AS1+antimiR-942-5p）组（用OIP5-AS1 siRNA和miR-942-5p inhibitor转染的细胞）。转染前将U87细胞接种到6孔板中，并将细胞密度调整为2×105个/孔。培养16 h后，采用Lipofectamine 3000试剂进行转染。转染6 h后，将U87细胞在含有10%FBS的培养基中培养48 h。最后，收获细胞并通过qPCR和Western blot检测各组细胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA和蛋白的表达水平，检测步骤同1.4和1.5。

1.7 MTT法测定细胞增殖活性将转染的U87细胞以2 000个/孔的密度接种到96孔板中，培养24、48、72 h。然后，在相应的时间点向每个孔中加入20 μL MTT溶液（5 g/L）孵育4 h。随后，去除孔中的溶液，加入150 μL二甲亚砜（DMSO）溶液以溶解甲臜产物，振荡10 min后，使用酶标仪在570 nm波长下测量每个孔的光密度（OD）值，评估细胞活力。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡转染48 h后，用胰蛋白酶消化转染的U87细胞，PBS洗涤后重新悬浮在1×结合缓冲液中，调整至1×106个/mL。将200 μL细胞悬液转移到试管中，并与5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混合在室温下避光反应15 min。最后，在1 h内用流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.9 Transwell迁移和侵袭实验对于侵袭分析，将转染的U87细胞重悬于无血清培养基中，然后取100 μL悬液（3×105个细胞）接种在预涂有Matrigel（孔径8 μm）的Transwell上室中。对于迁移分析，将转染的U87细胞（3×105个/孔）接种在未包被Matrigel的Transwell上室。之后，将500 μL含有10%FBS的DMEM培养基添加到下室。37℃孵育24 h后，使用棉签去除上室膜表面的基质胶和细胞，下室膜表面的细胞用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色30 min。最后，在倒置显微镜下拍照，并在Image J软件下计数随机读取的5个显微视野中穿膜细胞数，取平均值。

1.10 双荧光素酶报告基因检测使用StarBase v2.0数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）预测OIP5-AS1和miR-942-5p之间以及CHEK1和miR-942-5p之间的结合位点。将U87细胞接种到24孔板中（1×105个/孔），并采用Lipofectamine 3000将50 nmol/L OIP5-AS1-wt（CHEK1-wt）或OIP5-AS1-mut（CHEK1-mut）与50 nmol/L miR-NC或miR-942-5p mimic共转染至细胞。在转染后24 h收获和裂解细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统测量荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性被标准化为相应的海肾荧光素酶活性。

1.11 miR-942-5p过表达或敲低对CHEK1表达的影响将U87细胞以2×105个/孔的密度接种到6孔板中，分为miR-NC组、miR-942-5p mimic组、inhibitor-NC组、miR-942-5p inhibitor组。采用Lipofectamine 3000将miR-942-5p mimic、miR-942-5p inhibitor及其阴性对照miR-NC、inhibitor-NC分别转染至U87细胞中。转染48 h后，收获细胞并通过qPCR和Western blot检测各组细胞中CHEK1的mRNA和蛋白表达。

1.12 RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）实验使用Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行RIP实验。使用完全RIP裂解缓冲液裂解U87细胞，并将100 μL全细胞提取物与含有与人源抗Ago2抗体（1︰50）缀合的磁珠在4℃下孵育6~8 h。正常小鼠IgG抗体（1︰100）用作阴性对照。随后，将样品用洗涤缓冲液洗涤，并与蛋白酶K在55℃下孵育30 min，以从磁珠中分离RNA-蛋白质复合物。然后，提取免疫沉淀的RNA并进行qPCR分析。

1.13 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。计量数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验；2组间比较采用t检验。采用Pearson法分析脑胶质瘤组织中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表达水平的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人脑胶质瘤组织中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1表达与正常组织相比，脑胶质瘤组织中OIP5-AS1、CHEK1 mRNA水平显著升高，miR-942-5p水平显著降低（P＜0.05），见表2。相关性分析结果显示，脑胶质瘤组织中OIP5-AS1与miR-942-5p的表达水平呈负相关（r=-0.936，P＜0.01）；miR-942-5p与CHEK1 mRNA的表达水平呈负相关（r=-0.931，P＜0.01），OIP5-AS1与CHEK1 mRNA的表达水平呈正相关（r=0.935，P＜0.01）。此外，OIP5-AS1、CHEK1 mRNA在高级别胶质瘤组织中的表达明显高于低级别组织（P＜0.01），而高级别胶质瘤中的miR-942-5p水平明显低于低级别组织（P＜0.01），见表3。

Tab.2 Comparison of expression levels of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 mRNA between the two groups表2 2组研究对象中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表达水平比较（n=33，±s）

＊＊P＜0.01。

组织正常组织脑胶质瘤组织t OIP5-AS1 1.02±0.13 2.35±0.48 15.364＊＊miR-942-5p 0.99±0.10 0.55±0.09 18.788＊＊CHEK1 1.00±0.12 2.78±0.45 21.956＊＊

Tab.3 Comparison of expression levels of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 mRNA between gliomas of different pathological grades表3不同病理级别胶质瘤中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表达水平比较（±s）

＊＊P＜0.01。

肿瘤级别低级别胶质瘤高级别胶质瘤t n 14 19 OIP5-AS1 1.83±0.20 2.73±0.36 8.423＊＊miR-942-5p 0.71±0.10 0.43±0.08 8.938＊＊CHEK1 2.05±0.29 3.32±0.56 7.734＊＊

2.2 不同脑胶质瘤细胞系中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1表达与NHA细胞相比，脑胶质瘤细胞系U87、SHG-44、U251和H4中OIP5-AS1、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白水平升高；miR-942-5p mRNA水平降低（P＜0.05）；其中，U87细胞中OIP5-AS1、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白水平较高，miR-942-5p mRNA水平较低，因此选择U87细胞进行后续实验；见图1、表4。

Fig.1 Expression of CHEK1 protein in different glioma cells图1不同脑胶质瘤细胞中CHEK1蛋白表达

Tab.4 Comparison of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 levels between different glioma cells表4不同脑胶质瘤细胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1水平比较（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与NHA细胞比较，b与U87细胞比较，c与SHG-44细胞比较，d与U251细胞比较，P＜0.05。

细胞NHA U87 SHG-44 U251 H4 F OIP5-AS1 mRNA 1.01±0.11 3.26±0.40a 1.65±0.23ab 2.70±0.35abc 1.52±0.21abd 65.245＊＊miR-942-5p mRNA 1.02±0.09 0.29±0.05a 0.73±0.08ab 0.45±0.06abc 0.81±0.10abd 82.843＊＊CHEK1 mRNA 0.99±0.10 3.65±0.41a 2.30±0.27ab 1.49±0.23abc 1.81±0.25abc 84.278＊＊CHEK1蛋白0.24±0.04 0.87±0.09a 0.55±0.07ab 0.36±0.05abc 0.44±0.06abc 83.290＊＊

2.3 各组U87细胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1表达与NC组相比，si-NC组OIP5-AS1、miR-942-5p、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与NC组、si-NC组相比，si-OIP5-AS1组OIP5-AS1、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白水平降低，miR-942-5p水平升高（P＜0.05）；与si-OIP5-AS1组相比，si-OIP5-AS1+anti-NC组上述指标水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+anti-NC组相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组CHEK1 mRNA和蛋白水平升高，miR-942-5p mRNA水平降低（P＜0.05）；见图2、表5。

Fig.2 CHEK1 protein expression in U87 cells in each group图2各组U87细胞中CHEK1蛋白表达

2.4 沉默OIP5-AS1降低U87细胞增殖活力转染后24、48、72 h时，与NC组相比，si-NC组细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）；与NC组、si-NC组相比，si-OIP5-AS1组细胞活力显著降低（P＜0.05）；与si-OIP5-AS1组相比，si-OIP5-AS1+anti-NC组细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）；与si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+anti-NC组相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组细胞活力显著升高（P＜0.05）。见表6。

Tab.5 Comparison of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 levels between the five groups of U87 cells表5各组U87细胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1水平比较（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与NC比较，b与si-NC组比较，c与si-OIP5-AS1组比较，d与si-OIP5-AS1+anti-NC组比较，P＜0.05。

组别NC组si-NC组si-OIP5-AS1组si-OIP5-AS1+anti-NC组si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组F OIP5-AS1 mRNA 0.99±0.10 1.02±0.11 0.28±0.05ab 0.26±0.04ab 0.30±0.05ab 165.157＊＊miR-942-5p mRNA 1.00±0.12 1.01±0.10 3.54±0.39ab 3.60±0.41ab 1.32±0.20cd 142.939＊＊组别NC组si-NC组si-OIP5-AS1组si-OIP5-AS1+anti-NC组si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组F CHEK1 mRNA 1.00±0.11 0.98±0.09 0.39±0.05ab 0.36±0.06ab 0.87±0.09cd 88.736＊＊CHEK1蛋白0.82±0.09 0.84±0.10 0.32±0.05ab 0.30±0.04ab 0.72±0.08cd 75.734＊＊

2.5 沉默OIP5-AS1促进U87细胞凋亡与NC组相比，si-NC组细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；与NC组、si-NC组相比，si-OIP5-AS1组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与si-OIP5-AS1组相比，si-OIP5-AS1+anti-NC组细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；与si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+anti-NC组相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。见图3。

Tab.6 Comparison of the viability of U87 cells between the five groups表6各组U87细胞活力比较（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与NC比较，b与si-NC组比较，c与si-OIP5-AS1组比较，d与si-OIP5-AS1+anti-NC组比较，P＜0.05。

组别NC组si-NC组si-OIP5-AS1组si-OIP5-AS1+anti-NC组si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组F细胞活力（OD570）24 h 0.36±0.05 0.38±0.06 0.23±0.04ab 0.21±0.03ab 0.34±0.05cd 16.568＊＊48 h 0.58±0.07 0.60±0.07 0.37±0.05ab 0.36±0.05ab 0.55±0.06cd 17.730＊＊72 h 0.95±0.11 0.94±0.12 0.56±0.07ab 0.58±0.06ab 0.89±0.10cd 25.820＊＊

2.6 沉默OIP5-AS1抑制U87细胞迁移和侵袭与NC组相比，si-NC组迁移和侵袭细胞的数量差异无统计学意义（P＞0.05）；与NC组、si-NC组相比，si-OIP5-AS1组迁移和侵袭细胞的数量显著降低（P＜0.05）；与si-OIP5-AS1组相比，si-OIP5-AS1+anti-NC组迁移和侵袭细胞的数量差异无统计学意义（P＞0.05）；与si-OIP5-AS1组、si-OIP5-AS1+anti-NC组相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组迁移和侵袭细胞的数量显著升高（P＜0.05），见表7、图4。

Fig.3 Comparison of apoptosis levels of U87 cells in each group图3各组U87细胞凋亡水平比较

Tab.7 Comparison of migration and invasion numbers of U87 cells between the five groups表7各组U87细胞迁移、侵袭的数量比较（n=6，个/视野，±s）

＊＊P＜0.01；a与NC比较，b与si-NC组比较，c与si-OIP5-AS1组比较，d与si-OIP5-AS1+anti-NC组比较，P＜0.05。

组别NC组si-NC组si-OIP5-AS1组si-OIP5-AS1+anti-NC组si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p组F迁移细胞数143.20±18.57 150.36±20.14 62.81±9.56ab 59.44±7.12ab 127.13±15.08cd 52.220＊＊侵袭细胞数86.72±10.31 91.06±12.15 45.54±6.78ab 42.93±7.12ab 83.60±9.45cd 38.177＊＊

2.7 OIP5-AS1靶向miR-942-5p通过StarBase v2.0在线软件对OIP5-AS1潜在结合的miRNA进行生物信息学分析，发现OIP5-AS1含有与miR-942-5p区域互补的结合序列，见图5A。双荧光素酶实验结果显示，与miR-NC组相比，miR-942-5p过表达可显著降低含OIP5-AS1-wt报告载体细胞的荧光素酶活性（P＜0.01），对含OIP5-AS1-mut报告载体细胞的荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05），见图5B。RIP检测结果显示，与对照组（IgG）相比，含有Ago2的复合物可显著富集OIP5-AS1和miR-942-5p（P＜0.01），见图5C。

2.8 miR-942-5p直接靶向癌基因CHEK1通过StarBase v2.0在线软件预测miR-942-5p的潜在靶基因，发现miR-942-5p与CHEK1的3'-UTR存在结合位点，见图6A。双荧光素酶实验结果显示，与miRNC组相比，miR-942-5p过表达可显著降低含CHEK1-wt报告载体细胞的荧光素酶活性（P＜0.01），对含CHEK1-mut报告载体细胞的荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05），见图6B。qPCR和Western blot检测miR-942-5p过表达和敲低对CHEK1表达的影响，结果显示miR-942-5p过表达降低了CHEK1的mRNA和蛋白表达，而miR-942-5p敲低具有相反的效果（P＜0.01），见图6C~E。

3 讨论

3.1 OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1在胶质瘤中的表达近年来，lncRNA正在成为肿瘤等疾病发生发展过程中的重要调节因子。越来越多的证据表明，lncRNA在脑胶质瘤中存在异常表达，会影响肿瘤细胞的生物学过程，如NEAT1［14］、SNHG7［15］和PVT1［16］等lncRNA的功能已被揭示。OIP5-AS1作为众多基因的转录调节因子而受到关注。据报道，OIP5-AS1在多种肿瘤中过表达，与包括脑胶质瘤［5-6］在内的多种肿瘤患者的不良生存率相关；可调节和控制肿瘤生长并参与肿瘤进展，可能是多种肿瘤的有效生物标志物和潜在治疗靶点［17］。本研究中，OIP5-AS1在人脑胶质瘤组织和细胞系中高表达，而miR-942-5p下调，CHEK1上调，与以往的研究结果一致［5，10-11］。此外，OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA的表达与胶质瘤的病理分级有关。胶质瘤患者病理分级越高，OIP5-AS1、CHEK1 mRNA表达水平越高，miR-942-5p表达水平越低，提示上述3个因子可能与脑胶质瘤的发生和发展密切相关。

Fig.4 Migration and invasion of U87 cells in each group(×200)图4各组U87细胞迁移和侵袭情况（×200）

Fig.5 Interaction of OIP5-AS1 with miR-942-5p in glioma cells图5 OIP5-AS1与脑胶质瘤细胞中miR-942-5p的相互作用

Fig.6 miR-942-5p directly targets the oncogene CHEK1图6 miR-942-5p直接靶向癌基因CHEK1

3.2 OIP5-AS1通过靶向miR-942-5p在胶质瘤中发挥致癌作用lncRNA可充当miRNA的分子海绵，在细胞的多个过程中发挥重要作用。有研究显示，miR-942-5p在脑胶质瘤中呈低表达，其低表达可诱导脑胶质瘤的恶性表型［10］。本研究结果显示，脑胶质瘤组织中OIP5-AS1的表达水平与miR-942-5p的水平呈负相关。StarBase数据库预测发现OIP5-AS1序列含有与miR-942-5p序列互补的结合位点，提示OIP5-AS1和miR-942-5p之间可能存在靶向关系。双荧光素酶报告基因分析证实miR-942-5p是OIP5-AS1的靶标。为进一步确定OIP5-AS1和miR-942-5p的结合关系，使用Ago2抗体在U87细胞中进行RIP测定以验证OIP5-AS1和miR-942-5p是否可以与Ago2相互作用。结果显示，OIP5-AS1和miR-942-5p均可被Ago2富集，表明OIP5-AS1和miR-942-5p存在相互作用。为研究OIP5-AS1和miR-942-5p对脑胶质瘤生长的调节作用，本研究选择了U87细胞进行体外转染。结果显示，在U87细胞中使用siRNA沉默OIP5-AS1可上调miR-942-5p表达，有效抑制细胞增殖、侵袭和迁移能力，并促进细胞凋亡；而下调miR-942-5p表达促进了肿瘤细胞的恶性生物学功能，且减弱了OIP5-AS1沉默对细胞生物学行为的影响，提示OIP5-AS1可能通过调节miR-942-5p在脑胶质瘤的发病和进展中发挥作用。

3.3 CHEK1是miR-942-5p的潜在靶基因本研究发现，脑胶质瘤组织中miR-942-5p与CHEK1 mRNA相对表达量呈负相关。为进一步研究OIP5-AS1/miR-942-5p轴在调节胶质瘤发生中的潜在分子机制，通过生物信息学分析预测癌基因CHEK1可能是miR-942-5p的下游靶基因；双荧光素酶报告基因分析证实miR-942-5p可直接靶向CHEK1 mRNA的3'-UTR。然后，qPCR和Western blot分析显示，miR-942-5p过表达后，U87细胞中CHEK1的mRNA和蛋白水平显著降低，而下调miR-942-5p可增加U87细胞中CHEK1的表达水平，证实了CHEK1是miR-942-5p的直接靶标。以上这些结果表明，miR-942-5p可能通过直接结合CHEK1的3'-UTR来抑制CHEK1的表达。此外，沉默OIP5-AS1能够降低CHEK1的表达，同时上调miR-942-5p，抑制肿瘤细胞的恶性表型；而下调miR-942-5p可通过上调CHEK1表达，阻断OIP5-AS1沉默对肿瘤细胞恶性表型的抑制作用，提示OIP5-AS1可通过调节miR-942-5p/CHEK1轴来促进肿瘤的发生。

综上所述，沉默OIP5-AS1可能通过上调miR-942-5p抑制CHEK1表达，抑制脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡。OIP5-AS1可通过充当miR-942-5p的海绵来调节CHEK1表达，从而促进脑胶质瘤的发生和进展。本研究再次证实了OIP5-AS1可能是脑胶质瘤治疗的潜在靶点，加深了对其分子机制的认识，但OIP5-AS1/miR-942-5p/CHEK1网络在脑胶质瘤细胞其他生物学功能中的调控机制仍有待深入研究。此外，OIP5-AS1的功能机制仍需通过体内研究进一步验证。