幽门螺旋杆菌相关胃病脾胃湿热证及脾气虚证NLRP3/IL-1β的表达差异性研究

2022-12-21廖晓意陈昫唐舒婷樊冬梅兰绍阳胡玲

广州中医药大学学报 2022年12期

廖晓意，陈昫，唐舒婷，樊冬梅，兰绍阳，胡玲

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；3.广州中医药大学科创中心，广东广州 510405）

众所周知，胃癌（gastric cancer，GC）是一种发病率高、预后较差的恶性肿瘤。胃癌的发病机制尚未明确，目前普遍认为，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是最重要的危险因素。Hp感染导致胃黏膜慢性持续性炎症，引发胃黏膜从良性到恶性的慢性浅表性胃炎（chronic superficial gastritis，CSG）→慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）→肠上皮化生（intestinal metaplasia，IM）→异型增生（dysplasia，Dys）→胃癌病变。Hp相关胃病（Helicobacter pylori-related gastric diseases，HPGD）是对上述因Hp感染所引起的胃黏膜病变的简称。

本课题前期从“邪正交争”角度对HPGD脾气虚证和脾胃湿热证的胃黏膜保护因子[热休克蛋白70（HSP70）、黏蛋白1（MUC1）等]和攻击因子[白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素8（IL-8）等]进行研究，发现其在不同证型中呈现出不同的表达趋势[1]。其中，脾胃湿热证的Hp感染程度和感染率明显高于其他证型，同时伴随胃黏膜炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-8等mRNA和蛋白水平的高表达[2]。采用高通量二代测序法对HPGD患者进行筛选，发现与慢性胃炎组相比，胃癌患者的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain-related protein 3，NLRP3）和IL-1β表达均显著上调，提示NLRP3/IL-1β可能是HPGD胃黏膜病变过程中的关键炎症因子[3]。因此，本研究拟通过观察HPGD中脾胃湿热证及脾气虚证胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA的表达，进一步明确HPGD不同证型中炎症因子的差异性表达，证实不同证候是HPGD的内在病理因素。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2019年11月至2020年11月于广州中医药大学第一附属医院脾胃病科内窥镜室及胃肠外科就诊的95例HPGD患者为病例组，包括慢性浅表性胃炎43例，慢性萎缩性胃炎40例，胃癌12例；其中男53例，女42例。以上患者根据临床表现分为脾胃湿热证62例，年龄（53.79±12.84）岁；脾虚证33例，年龄（51.88±13.36）岁。同期于该院体检中心随机招募10例健康体检者为正常对照组，其中1例因样本质量不达标予以剔除，最终纳入研究9例，包括男4例，女5例；年龄（51.00±11.25）岁。各组患者的一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究获得广州中医药大学医学伦理委员会批准（批号：NO.K【2020】128），胃黏膜标本及临床信息的采集均获得患者的知情同意。

1.2诊断标准慢性浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎的诊断以《中国慢性胃炎共识意见（2017年，上海）》[4]作为标准，胃癌的诊断以2013年中华人民共和国卫计委颁布的《胃癌规范化诊疗指南（试行）》[5]作为标准；脾胃湿热证和脾气虚证的诊断标准以2002年《中药新药临床研究指导原则（试行）》[6]作为标准。

1.3纳入标准

1.3.1 病例组纳入标准 ①符合上述慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎或胃癌的诊断标准；②符合上述脾胃湿热证或脾气虚证的辨证标准；③自愿参加本研究，能配合胃黏膜标本及临床信息采集的患者。

1.3.2 正常对照组纳入标准 ①内镜下提示慢性浅表性胃炎，无活动性炎症，Hp检测阴性；②无呼吸、循环、泌尿、神经系统疾病及其他消化系统疾病；③无胃病的相关临床症状，舌淡红，苔薄白，脉象平和；④自愿参加本研究，能配合胃黏膜标本及临床信息采集的受试者。

1.4排除标准①合并有严重的心、脑、肺、肝、神经系统疾病患者；②近1个月使用过质子泵抑制剂或行Hp根除疗法的患者；③近期有消化道出血病史的患者；④孕妇、哺乳期的妇女。

1.5胃黏膜标本的采集研究对象均行电子胃镜检查，于胃窦距幽门口2～3 cm处的大、小弯或前、后壁钳取4块大小约0.2～0.3 cm的胃黏膜组织，其中1块行病理组织学检测，1块行快速尿素酶试验；2块放入装有RNA保存液的冻存管中后，立即投入液氮瓶并送至-80℃低温冰箱中保存，以备采用实时荧光定量多聚酶链式反应（quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测mRNA表达水平。胃癌标本则剪取手术切除的癌组织、距离肿物3 cm以上的远癌组织各4块，处理同前。

1.6Hp感染情况的检测采用快速尿素酶试验及胃黏膜病理切片美蓝染色法检测患者的Hp感染情况。两者均为阳性，其标本可诊断为Hp感染者；两者均为阴性，其标本则诊断为非Hp感染者；一阴一阳者不纳入本研究。

1.6.1 快速尿素酶试验内镜下钳取胃黏膜组织，立即置于幽门螺杆菌试纸上，等待3 min，观察试纸颜色变化，不变色者为Hp阴性，变红者为Hp阳性。

1.6.2 胃黏膜病理切片美蓝染色法检测美蓝染色采用按照硼酸0.5 g+亚甲蓝0.5 g+蒸馏水100 mL的比例配成的硼酸亚甲蓝液。将胃黏膜组织块固定于体积分数为4%的多聚甲醛内，常规酒精脱水，石蜡包埋，切片。切片脱蜡、脱水后，滴加硼酸亚甲蓝液5～10 min，水洗，封片，电子显微镜下观察、拍照。对医师采用盲法，并设定同一条件，由两名资深病理科医师分别完成所有胃黏膜标本Hp感染程度的评估。详见图1。

图1 不同幽门螺杆菌（Hp）感染程度的胃黏膜表现（美蓝染色，×400）Figure 1 Gastric mucosal manifestations of the studying subjects with different degrees of Hp infection（methylene blue stain，×400）

1.7胃黏膜中NLRP3和IL-1β mRNA表达水平的检测标本外送广州华银健康科技有限公司行qRT-PCR法检测。按TRIzol试剂操作说明书提取细胞RNA。使用反转录引物进行逆转录，在PCR仪中将RT反应程序设为：25℃5 min，55℃60 min，70℃15 min，12℃结束，再使用反转录产物（cDNA）做荧光PCR。以hGAPDH作为内参基因，NLRP3、IL-1β转录水平以2-ΔΔCt表示，实验重复3次，取平均值。引物序列见表1，引物扩增图见图2。

图2 NLRP3（A）、IL-1β（B）反转录引物扩增曲线图Figure 2 The amplification curve of reverse-transcription primers of NLRP3（A）and IL-1β（B）

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8统计方法采用SPSS 26.0统计软件进行数据的统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，满足正态性且方差齐者，组间比较采用t检验或单因素方差分析；不满足正态性或方差齐性者，组间比较选用Kruskal-WallisH检验。计数资料用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验；变量间相关性分析采用Spearman相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HPGD不同证型患者的Hp感染率比较表2结果显示：HPGD脾胃湿热证和脾气虚证患者的Hp感染率分别为82.26%（51/62）、75.76%（25/33），脾胃湿热证患者的Hp感染率有高于脾气虚证患者的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 幽门螺杆菌（Hp）相关胃病（HPGD）不同证型患者Hp感染率比较Table 2 Comparison of Hp infection rate in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types [例（%）]

2.2HPGD不同证型患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平比较表3结果显示：与正常对照组相比，HPGD脾胃湿热证和脾气虚证患者胃黏膜的NLRP3、IL-1βmRNA表达水平均显著升高（P＜0.05）。脾胃湿热证患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平均有高于脾气虚证患者的趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 幽门螺杆菌相关胃病（HPGD）不同证型患者NLRP3和IL-1β mRNA表达水平比较Table 3 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with Hp-related gastric disease（HPGD）of different syndrome types and in normal control group（±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，与正常对照组比较

2.3HPGD不同病种患者胃黏膜的NLRP3、IL-1βmRNA表达水平比较表4结果显示：与正常对照组相比，HPGD各病例组患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平均显著升高（P＜0.05）。胃癌患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平有高于慢性萎缩性胃炎、慢性浅表性胃炎的趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表4 幽门螺杆菌相关胃病（HPGD）不同病种患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表达水平比较Table 4 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in patients with different types of HPGD （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，与正常对照组比较

2.4胃癌患者胃黏膜不同部位的NLRP3和IL-1βmRNA表达水平比较表5结果显示：对胃癌患者的癌组织和距离肿物3 cm以上的远癌组织胃黏膜标本的NLRP3和IL-1β mRNA表达水平进行配对样本t检验（因其中2例远癌组织样本因采集检测不达标予以剔除，纳入剩余10例行配对检验），与远癌组织相比，癌组织胃黏膜标本的NLRP3 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），IL-1β mRNA表达水平有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表5 胃癌患者不同部位组织NLRP3和IL-1β mRNA表达水平比较Table 5 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in tissues from different sites of gastric cancer patients （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，与远癌组织组比较

2.5HPGD不同Hp感染情况患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平比较表6结果显示：与Hp阴性患者相比，Hp阳性患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），说明Hp感染可导致NLRP3、IL-1β表达水平升高。

表6 幽门螺杆菌相关胃病（HPGD）不同Hp感染情况患者胃黏膜NLRP3和IL-1β mRNA表达水平比较Table 6 Comparison of mRNA expression levels of NLRP3 and IL-1β in HPGD patients with different Hp infection profiles （±s，2-ΔΔCt）

注：①P＜0.05，与Hp阴性组比较

3 讨论

幽门螺杆菌（Hp）是一种革兰氏阴性菌，作为常见的致病菌，全球约有50%的人受到感染[7]。1994年，Hp被国际胃癌研究机构列为人类Ⅰ级致癌物。目前广泛认为根除Hp可有效预防胃癌的发生，延缓慢性浅表性胃炎（CSG）→慢性萎缩性胃炎（CAG）→肠上皮化生（IM）→异型增生（Dys）→胃癌（GC）的演变过程。在中医学中，CSG、CAG、GC等胃病多根据其症状表现可归属于“胃痛”“胃痞”“呕吐”“呃逆”“噎膈”等范畴，其病变部位在胃，与脾、肝关系密切。其中脾与胃同属中焦，互为表里，两者紧密相连，因此胃病也多可牵连于脾。对不同证型的胃黏膜病理观察结果显示，脾胃湿热证患者的胃黏膜病理多表现为隆起糜烂[8]，脾气虚证患者多表现为黏膜白相增多[9]，且前者炎症程度高于后者。说明不同证型可能是导致胃黏膜病理变化的内在因素，且与炎症因子的异常高表达密切相关。

本研究结果显示：脾胃湿热证HPGD患者胃黏膜的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平显著高于正常对照组，且与脾气虚证患者比有偏高的表达趋势，证实了脾胃湿热证与NLRP3、IL-1β的内在联系。同时发现脾胃湿热证Hp感染率有高于脾气虚证的趋势，这与本课题组前期的研究结果及国内相关研究结果一致[9-10]。中医对脾胃湿热的描述最早可见于《素问·至真要大论》，提出：“诸湿肿满，皆属于脾。”中医认为，湿热证具有病性黏滞、缠绵难愈的特点。目前普遍认为，Hp在病因上可归于中医外感邪气范畴，与湿热邪气致病的机制类同，且其难以根治、易反复感染的致病特征与湿热黏滞的发病特点极为相似。同时，“湿热”也是Hp生长、繁殖的内在环境。“湿热”的中心病位在脾胃，脾为湿脏、胃为燥脏，脾胃同居中焦，主运化水液，故“湿热”易在脾胃滋生盘踞。由此可见，脾胃湿热证与Hp感染互相影响，互为因果。

薛雪的《湿热病篇》将湿热的发病机理概括为“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，外内相引，故病湿热”，即内伤为本，外邪是因，这与Hp感染和脾胃湿热证的致病过程不谋而合。Hp感染是HPGD脾胃湿热证发病的外因，而NLRP3、IL-1β等炎症因子在细胞内的过度表达则是从内部协同Hp致病，导致胃黏膜持续的炎症状态，从而引起病理结构改变。NLRP3炎症体的激活可能是脾胃湿热证的生物学实质之一，是参与脾胃湿热证HPGD发病的重要因素。

NLRP3炎症体是一种包括NLRP3蛋白和适配器ASC的半胱氨酸天冬氨酸酶1（caspase-1）激活分子平台，其中NLRP3蛋白作为一种模式识别受体（pattern-recognition receptors，PRRs），可定向识别宿主细胞质中的微生物分子[11]。Hp通过其主要毒力因子细胞毒素相关基因A（cytotoxin-associated gene A，Cag A）蛋白刺激NLRP3蛋白，激活NLRP3炎症体，从而活化caspase-1。活性caspase-1可促进IL-1β的成熟、释放，成熟的IL-1β参与多种免疫反应，其接收内皮细胞的传导信号，将免疫细胞募集到感染或受损部位[12]。IL-1β炎症反应可以抑制胃酸分泌并引起胃腺体萎缩，从而促进定植菌的近端迁移，引起胃内微环境改变，造成体部或多灶性胃炎，后者往往会向肠上皮化生发展，最终演变为肠型胃癌。此外，它还可以直接诱导胃癌细胞的增殖[13-15]。

本研究对HPGD不同病种的NLRP3、IL-1β mRNA表达水平进行比较，结果显示：病例组较正常对照组显著升高，其中GC较CSG、CAG有更高的表达趋势。同时，对GC患者胃黏膜癌组织和远癌组织的NLRP3、IL-1β mRNA表达进行比较，发现癌组织炎症因子表达水平显著高于远癌组织。以上结果均说明NLRP3、IL-1β与GC的发生密切相关，NLRP3、IL-1β或许可作为GC早期筛查和治疗的靶点。结合课题组前期对GC和正常受试者胃黏膜的高通量二代基因测序，结果显示IL-1β的表达在GC中显著上调，且差异基因通过NOD样受体信号通路进行富集[3]，故认为Hp可激活NLRP3炎症体，从而提高IL-1β在HPGD患者胃黏膜中的表达，引起炎症级联反应，参与CSG→CAG→IM→Dys→GC的病理过程。

综上所述，Hp感染后胃黏膜的IL-1β、NLRP3的高表达，导致胃黏膜的慢性持续性炎症，可能是引起胃黏膜恶性转变的重要因素之一。而脾胃湿热证可能是Hp感染后的内在病理因素之一，其与外邪Hp感染协同，共同参与Hp相关胃病由良性至恶性发展的过程。由于本研究纳入样本量仍较少，脾胃湿热证和脾气虚证的NLRP3、IL-1β mRNA表达均高于正常受试者，但两组之间比较差异均无统计学意义，后续将继续扩大样本，并扩展更多中医不同证候，以进一步证实中医证候参与Hp感染后的胃黏膜不同结局的过程，为中医药根除Hp防治胃癌提供更多基础理论依据。