不同炮制方法对柿叶成分及止咳祛痰作用的影响

蒋 馨，李 健，赖国校，李利群，周改莲，郝二伟

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学 广西中药药效研究重点实验室，广西 南宁 530200；3.广西中医药大学 农作物废弃物功能成分协同创新中心，广西 南宁 530200；4.广西中医药大学 高等职业技术学院，广西 南宁 530001)

柿叶来源于柿树科植物柿DiospyroskakiThumh.的新鲜或干燥叶，性味苦、寒，归肺经，具有润肺镇咳、活血止血、清热解毒等功效。其主要有效成分包括黄酮类、三萜类、有机酸、香豆素类、植物甾醇类、脂肪酸类等[1]，具有抗氧化、降血糖、抗菌抗炎、抗肿瘤、保肝、保护心脑血管等作用[2]。目前，对于柿叶的研究主要集中于其化学成分和药理作用方面，关于其炮制的研究较少，且2015版《中国药典》并未收载，相关炮制规范仅记载了柿叶净制方法，因而在柿叶加辅料炮制工艺方面尚属空白。本研究基于中药炮制理论，选用酒炙、炒炭、蜜炙等炮制方法对柿叶进行炮制加工，对比柿叶不同炮制品，以及炮制前后相关有效成分的含量，进行蜜炙前后柿叶镇咳祛痰作用的药效比较研究，为优化柿叶炮制工艺提供参考和依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠[(25±2)g]160只，雌雄各半，购自广东省动物实验中心，随机分笼，控制室温25 ℃，12 h光照12 h黑暗循环，自由饮食。

1.2 药品、试剂

柿叶(购自广西金秀县，经广西中医药大学药用植物教研室银胜高副教授鉴定为柿树科植物柿DiospyroskakiThumh.的干燥叶)。

枸橼酸喷托维林片(国药集团容生制药有限公司，16072711)，复方愈创木酚磺酸钾口服液(广州白玉山星群股份有限公司，20161115)，芦丁对照品(wkq161011104)；槲皮素对照品(wkq16063005)；山柰酚对照品(wkq17032203)，对照品皆产自四川省维克奇生物科技有限公司；色谱级乙腈(Fisher Scienfific)，其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

L5紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；LC1260-1_VWD 高效液相色谱仪；SQP型分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 柿叶炮制品制备

严格按2020年版《中国药典》四部炮制通则炮炙项下 “炒”和“炙法”所载方法，对柿叶样品分别进行炒黄、炒焦、炒炭、蜜炙、酒炙和醋炙处理，制备柿叶炮制品。以上所有炮制品均打粉过四号药筛，备用。

2.2 柿叶总黄酮含量测定

2.2.1 供试品制备 称取柿叶粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇12.5 mL，超声提取45 min，补足失重，过滤，精密量取滤液0.8 mL于25 mL容量瓶中，再加入1 mL 5% AlCl3，用60%乙醇定容，摇匀即得。

2.2.2 对照品溶液制备 称取芦丁对照品约为9 mg，精密称定为9.4 mg，置于50 mL容量瓶中，60%乙醇定容，摇匀，配得浓度为0.188 mg·mL-1对照品溶液。

2.2.3 检测波长选择 取柿叶供试品溶液和对照品溶液在200～800 nm之间进行扫描发现，对照品溶液和供试品溶液在410 nm处皆有最大吸收，峰形好，故选410 nm为检测波长。

2.2.4 方法学考察 (1)线性关系考察。精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 芦丁标准溶液于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5% AlCl3溶液，用60%乙醇定容，摇匀，在紫外检测波长为410 nm处测定吸光度，记录。以对照品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，进行线性回归，其标准曲线方程为：y=23.012x+0.004 3(R2=0.999 9)，结果表明芦丁在0.007 52～0.037 60 mg·mL-1范围内线性关系良好。

(2)精密度实验。精密量取对照品溶液0.8 mL于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5% AlCl3溶液，60%乙醇定容，摇匀，在波长为410 nm处连续测定6次，其吸光度分别为0.588 5、0.586 7、0.585 1、0.586 0、0.585 0、0.584 6，结果对照品溶液吸光度的RSD=0.21%，表明仪器精密度良好。

(3)稳定性实验。依“2.2.1”项方法制备一份供试品，分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h时测定吸光度，考察样品溶液稳定性。在上述条件下，测得吸光度分别为0.743 8、0.768 2、0.772 2、0.766 5、0.764 5、0.758 6、0.758 4、0.763 3，RSD=1.14%，说明供试品在24 h内稳定性良好。

(4)重复性实验。取同一样品依“2.2.1”项方法平行制备6份供试液，按上述条件测定吸光度，计算其含量，分别为22.88、22.86、22.79、22.28、22.15、22.87 mg·mL-1，平均含量为22.64 mg·mL-1，RSD=1.46%<2.0%，说明该方法重复性良好。

(5)加样回收率实验。取已知含量柿叶生品约0.25 g 6份，精密称定，分别加入2.8 mg的芦丁对照品溶液，超声提取45 min，补足失重，过滤，精密吸取滤液0.8 mL于25 mL容量瓶中，再加入1 mL 5% AlCl3，用60%乙醇定容即得。于410 nm波长处测定吸光度，计算回收率。对照品平均回收率为102.5%，RSD=1.20%，表明该测定方法结果准确。

2.2.5 不同炮制品总黄酮测定 依“2.2.1”项方法制备各种炮制品供试液。在紫外检测波长410 nm处测定，记录吸光度，平行3组，取其平均值。不同炮制品总黄酮平均含量见表1。

表1 总黄酮平均含量 (n=3)

2.3 HPLC测定柿叶中芦丁含量

2.3.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为以乙腈，B为纯水，梯度洗脱，见表2；检测波长360 nm；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL。

表2 梯度洗脱

2.3.2 供试品制备 取柿叶生品粉末约0.5 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入5 mL 75%甲醇，称重，超声提取45 min，补足失重，摇匀后过滤，离心后用微孔滤膜过滤，即得。

2.3.3 对照品制备 称取芦丁2.0 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用75%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成0.20 mg·mL-1对照品溶液。

2.3.4 方法学考察 (1)线性关系。精密量取0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中，75%甲醇溶解并稀释至刻度，微孔滤膜过滤于进样瓶中。按上述色谱条件测定，绘制标准曲线，以对照品溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得芦丁的线性方程为：y=10 649x-2.905(R2=1)，表明芦丁的浓度在0.004 5 mg·mL-1～0.072 mg·mL-1范围内线性关系良好。

(2)精密度实验。取对照品溶液，离心后用微孔滤膜过滤于进样瓶中，分别连续测定6次，记录峰面积，得到槲皮素峰面积的RSD=0.34%，表明仪器精密度良好。

(3)稳定性实验。依“2.3.2”项方法制备一份供试品，分别在0、1、2、4、8、12 h进样测定，记录峰面积值，结果供试品溶液中芦丁峰面积的RSD值为1.67%，表明供试品在12 h内稳定性良好。

(4)重复性实验。依“2.3.2”项方法制备6份供试品，进样20 μL，其出峰面积RSD为1.94%，表明该方法重复性良好。

(5)加样回收实验。称取6份柿叶粉末约0.25 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入约0.129 mg的对照品溶液，称重，超声提取45 min，补足失重，摇匀后过滤，离心后用微孔滤膜过滤于进样瓶中。按上述色谱条件测定峰面积，计算其回收率。其回收率平均为95.11%，RSD=1.07%，表明该方法测定结果准确。

2.3.5 含量测定 依“2.3.2”项方法制备不同炮制品供试液，按上述色谱条件测定峰面积，通过外标一点法计算含量，平行3组，取其平均值。芦丁平均含量见表3。

表3 芦丁平均含量 (n=3)

2.4 HPLC同时测定柿叶槲皮素、山柰酚含量

2.4.1 色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相 A为以乙腈，B为纯水，洗脱为梯度洗脱，洗脱程序见表4；检测波长360 nm；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量为10 μL。

表4 梯度洗脱

2.4.2 供试品制备 取柿叶生品粉末约0.5 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入5 mL 75%甲醇，称重，记录数值，超声提取45 min，补足失重，摇匀后过滤，离心后用微孔滤膜过滤于进样瓶中，即得。

2.4.3 对照品制备 称取槲皮素2.4 mg、山柰酚2.0 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容，摇匀，配制成槲皮素浓度为0.24 mg·mL-1，山柰酚浓度为0.20 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.4.4 方法学考察 (1)标准曲线制作。精密量取0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容，再用微孔滤膜过滤于进样瓶中。按上述色谱条件测定峰面积，绘制标准曲线，得槲皮素的线性方程为：y=33 287x-40 429(R2=0.999 9)，表明槲皮素的浓度在0.006 mg·mL-1～0.12 mg·mL-1范围内线性关系良好；山柰酚的线性方程为：y=39 121x-29.458(R2=0.999 9)，表明山柰酚浓度在0.005～0.1 mg·mL-1范围内线性关系良好。

(2)精密度实验。取同一对照品混合溶液，离心后用微孔滤膜过滤于进样瓶中，连续测定6次，记录峰面积，槲皮素峰面积的RSD为0.96%，山柰酚峰面积的RSD为0.82%，表明仪器精密度良好。

(3)稳定性实验。依“2.3.2”项方法制备1份供试品，按上述色谱条件分别于0、1、2、4、8、12 h进样测定，记录峰面积值，得槲皮素峰面积的RSD值为1.14%，山柰酚峰面积的RSD值为1.24%，表明柿叶中槲皮素与山柰酚在12 h内稳定。

(4)重复性实验。依“2.3.2”项方法制备6份供试品，按上述色谱条件测定峰面积，得槲皮素RSD为0.61%；得山柰酚RSD为0.88%，表明该方法的重复性好。

(5)加样回收实验。称取6份柿叶粉末约0.25 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，加入约0.096 mg的对照品溶液，称重，记录数值，超声提取45 min，补足失重，摇匀后过滤，离心后用微孔滤膜过滤于进样瓶中。按上述色谱条件测定峰面积，计算其回收率。其平均回收率为103.8%，RSD=1.49%，表明该方法测定结果准确。

2.4.5 含量测定 依“2.4.2”项方法制备各种炮制品样液，按上述色谱条件测定峰面积，通过回归方程计算含量，平行3组，取其平均值。槲皮素、山奈酚平均见表5。

表5 槲皮素、山奈酚平均含量 (mg·g-1，n=3)

2.5 镇咳实验

2.5.1 实验分组 取KM小鼠80只，雌雄各半，随机分为8组，分别为空白组、阳性对照组(枸橼酸喷托维林片(咳必清)，13 mg·kg-1)、生品高剂量组(30 mg·kg-1)、生品中剂量组(20 mg·kg-1)、生品低剂量组(10 mg·kg-1)、蜜炙品高剂量组(30 mg·kg-1)、蜜炙品中剂量组(20 mg·kg-1)和蜜炙品低剂量组(10 mg·kg-1)，每组8只。空白组给予等体积蒸馏水；连续灌胃7 d，末次给药 30 min后，将小鼠放入滴有浓氨水(约50 μL浓氨水)的250 mL广口瓶中，瓶口密闭起计时，观察并记录小鼠咳嗽的潜伏期，以及开始咳嗽后3 min内小鼠的咳嗽次数。

表6 小鼠咳嗽潜伏期及次数

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.6 祛痰实验

2.6.1 实验分组 动物分组同“2.5.1”，其中阳性药组灌胃复方愈创木酚磺酸钾口服液(氯化铵)0.1 mL，末次给药后1 h，腹腔注射0.5%酚红生理盐水溶液，30 min后取血，颈椎脱臼处死小鼠，剪开颈前皮肤，剥离气管，取上回喉至下肺分叉处，放入5% NaHCO31 mL中洗出酚红，收集洗液，离心，取上清于546 nm处测定OD值。

2.6.2 酚红标准曲线 称取一定量的酚红，准确称定，加5% NaHCO3溶液溶解，配成浓度为100 μg·mL-1溶液，然后依次稀释为每mL含酚红1、2、3、4、5、6、7 μg，于波长546 nm处测得吸光度(A)分别为0.076、0.215、0.323、0.431、0.558、0.658、0.786。以酚红剂量(C)为横坐标、A为纵坐标，做标准曲线。得到回归方程：y=0.1161x-0.0291(R2=0.998 8)。

2.6.3 结果分析 依据回归方程计算小鼠酚红分泌量。见表7。

表7 小鼠气管酚红分泌量

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

本实验发现，柿叶炮制后其总黄酮、芦丁含量均低于生品，这可能是炮制过程中需高温加热，而黄酮类化合物对光、热的稳定性较差[3]，在160 ℃以上加热芦丁，可使其分解[4]，导致其总黄酮、芦丁含量降低，炒炭后其含量降低尤为显著，因此若将柿叶中黄酮类化合物作为主要有效成分，应尽量防止对其高温炮制。柿叶炒黄、酒炙后槲皮素、山柰酚含量高于生品，其他炮制品均低于生品。芦丁受热分解为槲皮素及其他成分[4]，而槲皮素在314 ℃会继续分解。因此，在一定温度和作用时间下，槲皮素含量会较生品升高，而超过某一限度其则会继续分解，含量降低。槲皮素和山柰酚溶于热醇，因此其酒炙后含量会有所升高。

柿叶蜜炙品和生品均能止咳祛痰，但蜜炙品祛痰止咳功效显著优于生品。柿叶中的黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚均有抗菌抗炎作用[5-8]。槲皮素可作为单一成分药品使用，其祛痰、止咳作用较好，并有一定的平喘作用。此外，槲皮素还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量等作用，可用于治疗慢性支气管炎[5]。柿叶的润肺镇咳功效可能与槲皮素有关，也与黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚的抗菌抗炎作用有关。依据中药炮制理论，中药蜜炙后可增强其润肺镇咳功效。但实验发现，蜜炙后柿叶的黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚较生品均降低。由此推测，柿叶其他成分可能也具有润肺镇咳功效，蜜炙后其他化学成分含量可能发生了变化，从而增强了柿叶止咳化痰功效。蜂蜜本身止咳化痰功效并不明显，但搭配其他药材后，即可增强其功效，如蜜炙枇杷叶，这可能是柿叶炮制后，止咳化痰作用增强的原因。

柿叶作为农作物废弃物，具有很大的开发利用潜力，而目前学界对其研究还不多，柿叶炮制研究，更是鲜见。因此，应深入探究其药效成分及药理作用，厘清其炮制前后各成分的变化与药效的关系，从而完善柿叶炮制工艺，填补研究空白，为临床用药提供依据。