基于谱效关系的荆芥穗药效部位治疗结肠癌药效质量标志物研究

贾梦楠，王 帅，2，李天娇，2，包永睿，2，孟宪生，2*

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)

荆芥穗为唇形科植物荆芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗，主产于江苏、河北、浙江、江西等地。其性辛，微温，归肺、肝经，具有解表散风、透疹、消疮的功效，炒炭可止血[1]。《本草图经》[2]和《滇南本草》[3]均记载其可治便血，治妇人血风，止女子暴崩。现代药理研究表明，荆芥穗具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒等作用[4-6]。近年来，学界主要围绕荆芥穗药效部位含量测定、质量控制等方面开展研究，但其治疗结肠癌的药效物质基础尚未明确。因此，本研究开展荆芥穗药效部位治疗结肠癌的物质基础研究，探讨其活性部位与抗肿瘤药效之间的关联性，明确荆芥穗抗肿瘤的药效质量标志物，为荆芥穗药效部位的研发和质量控制提供参考。

本实验采用HPLC法建立不同产地荆芥穗药材化学轮廓谱，采用人肠癌HT-29细胞体外模型开展不同产地荆芥穗抗肠肿瘤药理药效研究；运用灰色关联及偏最小二乘分析法，将化学轮廓谱与抗肿瘤活性进行关联，筛选荆芥穗抗肠肿瘤的潜在药效质量标志物，可用于荆芥穗的质量控制和评价，为荆芥穗的质量控制提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器

1260 II型超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；SUNRISE酶标仪(瑞士TECAN公司)；US AUTOFLOW型CO2培养箱(德国NUAIRE公司)；AE31型倒置相差显微镜(Motic公司)；旋转蒸发仪(美国SENCO公司)。

1.2 试剂与药物

胎牛血清(美国GIBCO公司)；McCoy’s 5A培养基(美国GIBCO公司)；胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；青霉素/链霉素溶液(Meilunbio公司)；CCK-8增强型溶液细胞活性检测试剂盒(Meilunbio公司)。HPD-400大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司)；原儿茶醛(批号：19031002)、咖啡酸(批号：17122804)、对香豆酸(批号：20102301)、木犀草苷(批号：21032701)、橙皮苷(批号：19071201)、异绿原酸C(批号：200912)、木犀草素(批号：17120702)、香叶木素(批号：181101)；10批荆芥穗饮片(购买信息见表1，由辽宁中医药大学中药植物教研室许亮教授植物鉴定为唇形科植物荆芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗)。

表1 不同产地荆芥穗饮片的样本信息

1.3 细胞株

人结肠癌细胞株HT-29(赛百慷生物技术股份有限公司)。

1.4 样品制备

1.4.1 荆芥穗提取物制备 精密称取不同产地荆芥穗药材粉末(过4号筛)10.00 g，以15倍量的70%乙醇回流提取3次，放冷滤过，合并提取液，旋蒸浓缩至100 mL，采用HPD-400树脂进行纯化，收集洗脱液，45 ℃真空旋蒸至浓稠，70 ℃水浴蒸干即得荆芥穗药效部位纯化物。

1.4.2 供试品溶液制备 精密称取荆芥穗药效部位0.002 5 g，置于5 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，超声(功率200 W，频率40 kHz)1 min溶解，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.4.3 含药培养液制备 精密称定不同产地荆芥穗药效部位，以含体积分数为10%的优质胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗溶液的McCoy’s 5A培养基为溶剂制成浓度为0.4 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2 方法与结果

2.1 化学轮廓谱建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流动相：0.1%甲酸水(A)- 乙腈(B)；梯度洗脱程序：(0～5 min，15%→18%B；5～7 min，18%→18%B；7～9 min，18%→20%B；9～13 min，20%→20%B；13～25 min，20%→26%B；25～35 min，26%→36%B；35～40 min，36%→50%B)；40～43 min，50%→70%B；体积流量0.6 mL/min；柱温30 ℃；进样量3 μL；检测波长280 nm。

2.1.2 方法学考察 供试品各色谱峰相对保留时间，相对峰面积精密度、稳定性和重复性RSD均小于4%。

2.1.3 化学轮廓谱建立 精密吸取10批供试品溶液各3 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样，化学轮廓谱见图1。

图1 不同产地样品乙醇提取物化学轮廓谱

根据荆芥穗药效部位的化学轮廓谱，从中筛选出22个主要色谱峰，得出其保留时间与峰面积，用于下一步谱效分析。经对照品指认，1号峰为原儿茶醛，2号峰为咖啡酸，4号峰为对香豆酸，6号峰为木犀草苷，8号峰为橙皮苷，9号峰为异绿原酸C，14号峰为木犀草素，19号峰为香叶木素。见图2。

2.2 荆芥穗药效部位对人肠癌HT-29抑制作用

采用AO/EB(吖啶橙/溴化乙锭)染色法计算荆芥穗药效部位对人肠癌HT-29抑制率。取处于对数生长期、生长状态良好的人肠癌HT-29细胞，以每孔1.5×104个接种于48孔板中，给药干预后，每孔避光加入200 μL的AO/EB染液，在实时荧光显微镜下观察，活力细胞为绿色荧光。通过ImageJ 2.1.0软件对荧光细胞计数，可见相对空白组，各给药组活力细胞数量均有不同程度的减少。见图3。

图2 混合对照品溶液及样品溶液的HPLC

图3 不同产地荆芥穗药效部位对人肠癌HT-29细胞活力影响

荆芥穗药效部位对人肠癌HT-29细胞的抑制作用以7 500 cell/孔的密度将HT-29细胞接种于96孔培养板，给药干预后，避光加CCK-8溶液，于37 ℃恒温培养箱中培养45 min后，用酶标仪在450 nm处扫描，测定吸光值(OD)，与空白组比较，各给药组HT-29细胞吸光度明显升降低(P<0.05)。

AO/EB染色法、CCK-8法权重系数为各50%，计算得到的荆芥穗药效部位作用于人肠癌HT-29细胞的抑制率。见表2、图4。

2.3 灰色关联度分析

根据不同产地荆芥穗药效部位化学成分轮廓谱，共提取出22个特征峰。将影响整体行为的数据进行分列，以反映系统药效行为特征的数据序列(荆芥穗药效部位作用于人肠癌HT-29细胞总抑制率)为参考数列，即母序列；以影响系统药效行为的因素数据序列(不同产地荆芥穗药材的不同峰面积经归一化处理后)为比较数列，即子系列。采用灰色关联度分析软件(Grey ModeLing V 3.0)进行分析，得出不同产地药材色谱峰与体外药效学评价指标之间的关联系数。见表3。

表2 不同产地乙醇提取物对人肠癌HT-29细胞的抑制率 (n=4)

图4 荆芥穗药效部位作用于人肠癌HT-29细胞总抑制率

由此可知，这22个主要色谱峰代表的化学成分对肠癌的抑制作用具有一定的差异性，其中相关系数大于0.85的色谱峰为1、2、4、5、6、8、9、14、16、17、19、21号峰。

表3 不同产地样品乙醇提取物的色谱峰峰面积以及关联系数

2.4 偏最小二乘回归分析

由于灰色关联分析方法仅标识成分对药效的贡献，而不表示其正相关或是负相关，因此，在灰色关联分析方法基础上进行偏最小二乘回归分析方法可获得正相关的药效成分。本研究采用SIMCA 14.1统计软件，以灰色关联度分析中相关系数>0.85的14个主要色谱峰为自变量(X)，药效数据为因变量(Y)，对0.4 mg/mL给药浓度时的数据进行偏最小二乘回归分析(PLSR)，所得拟合模型R2>0.9，Q2>0.8，说明潜在因子的信息综合解释能力较好，并具有良好的预测性，结果见图5。经UVN标准化后，回归方程为：Y=5.778 31+0.128 551X1+0.122 33X2+0.077 550 7X3-0.116 832X4+0.103 907X5+0.036 709 8X6+0.030 710 5X7+0.127 702X8-0.113 476X9-0.109 755X10+0.123 998X11-0.111 015X12。

其中，回归系数的正、负代表各成分对抗肠肿瘤的正相关或负相关，可见1、2、4、6、8、9、14、19号共计8个色谱峰对药效贡献较大，起到正向促进作用。

图5 0.4 mg/mL给药浓度标准化回归系数

3 讨论与结论

由于HT-29细胞经荆芥穗药效部位处理后，可能出现活细胞数不变，但代谢率降低，细胞呼吸减弱，使CCK-8法OD值稍有降低的现象。而AO/EB染色法可直接观测活细胞数量。因此，本研究赋予AO/EB染色法与CCK-8法两种方法权重系数各50%，得到不同产地荆芥穗药效部位抗人结肠癌HT-29细胞的抑制率。

本研究采用HPLC法构建了10批荆芥穗样品化学轮廓谱，获得22个共有峰。采用灰色关联分析获得了荆芥穗抗肿瘤活性较强的12个色谱峰，采用偏最小二乘回归方法对其进行谱效相关分析，获得了荆芥穗抗肿瘤活性较强且正相关的8个色谱峰。由于灰色关联分析方法仅标识成分对药效的贡献，而不表示其正相关或是负相关，因此，本研究在灰色关联分析方法基础上进行偏最小二乘回归分析方法可获得正相关的药效成分。

本研究基于特征图谱和药效学研究，得到的8个成分与抗肠肿瘤作用密切相关。对香豆酸通过ros-线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡[7]，木犀草素对结肠癌细胞增殖、迁移及上皮-间充质转化有抑制作用[8]，橙皮苷能有效促进结肠癌细胞凋亡，从而抑制结肠癌细胞增殖，有效诱导结肠癌细胞自噬[9]，香叶木素可显著降低结肠癌细胞在裸鼠体内的肿瘤生长速度[10]，木犀草苷可通过改善肠道微生物进而调理肠道健康[11]，原儿茶醛和异绿原酸C主要起抗炎作用[12-13]，咖啡酸具有良好的止血功效。因此，荆芥穗活性部位中的多种成分可能通过协同作用发挥抗炎、抗肠肿瘤作用，可初步推测其为荆芥穗的潜在的药效质量标志物，可为荆芥穗的质量控制提供参考。