载脂蛋白CI 与肾母细胞瘤疾病分期的相关性分析

陈枫 岳霖琳 张燕萍 刘金平 刘海金 曾林山 陈俊敏

1.赣南医学院第一附属医院小儿外科，江西赣州 341000；2.赣南医学院第一附属医院重症医学科，江西赣州 341000；3.广东省人民医院赣州医院（赣州市立医院）检验科，江西赣州 341000

肾母细胞瘤为儿童群体常见肾脏恶性肿瘤类型，对患儿生命健康及成长发育造成了极大影响[1]。因此，早期对肾母细胞瘤进行准确评估具有重要意义。但当前临床用于评估肾母细胞瘤的指标缺乏良好的特异性及敏感性，故需寻找新的指标对疾病进行诊断评估[2]。随着临床研究深入，载脂蛋白CI 在多种疾病诊疗评估中的应用价值逐渐引起关注，研究发现，载脂蛋白CI 可参与不同病理、生理反应，甚至和恶性肿瘤发病及进展具有密切关联性[3-4]。但当前关于载脂蛋白CI 与肾母细胞瘤疾病分期关联性的研究较少，基于此，本研究拟选取肾母细胞瘤患儿50 例，通过设置对照组，探讨上述内容。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010 年8 月至2022 年2 月赣南医学院第一附属医院收治的肾母细胞瘤患儿50 例设为研究组，另选取门诊体检健康儿童20 名设为对照组。研究组中，男27 例，女23 例；年龄3～10岁，平均（6.23±3.11）岁；疾病分期（COG 分期）：Ⅰ期10例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期10 例，Ⅴ期10 例。对照组中，男11 名，女9 名；年龄2～10 岁，平均（6.05±3.24）岁。两组患儿的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：①研究组均经病理检查确诊；②研究组既往未采取放化疗治疗。排除标准：①存在其他良恶性肿瘤者；②存在血液系统、代谢系统及自身免疫系统疾病者；③存在全身性感染性疾病者；④存在精神系统疾病者。患儿家属知晓本研究，签署同意书，且本研究经医学伦理委员会审批通过（伦理审批号：LLSC-2022041801）。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 两组均在晨起时空腹采集外周静脉血置于血清分离管中，4℃条件下过夜，离心处理（1000×g，15 min），分别置于不同EP 管，置于-80℃环境保存；研究组瘤体标本均为手术切除或穿刺活检的新鲜标本，分装至不同冻存管，液氮速冻处理，置于-80℃环境或液氮罐储存，经甲醛固定标本，石蜡包埋。

1.2.2 血清载脂蛋白CI 检测①样本准备：血清样本取出后置于4℃环境溶解，4℃离心（1000×g，10 min），取10 μl 稀释，加入PBS（490 μl），终体积500 μl；反复颠倒混匀，充分稀释；取稀释液（10 μl）加入PBS（390 μl），终体积400 μl，置于4℃环境储存。②试剂准备：将试剂包括前期稀释后血清样本缓慢升至室温；首先实施标准品稀释，取1 ml 稀释液加入标准品内，室温静置10 min，轻轻摇晃混匀，避免起泡；依据说明书稀释，随后依次成倍稀释标本品，获取不同浓度样本，以0 ng/ml 作空白孔；A、B 检测液快速离心，按1∶100 将对应稀释液配为工作液。③实验步骤：设立空白孔、血清样本孔、标准孔共3 大组；将8 个标准品加入板孔，100 μl/孔；空白孔加入标准品稀释液100 μl，其余各孔加入100 μl 血清样本，孔板盖上覆膜，37℃条件下孵育60 min；废液去除、甩干，各孔加入100 μl 检测溶液A 工作液，继续孵育60 min；废液去除，各孔加入洗涤液350 μl，室温孵育1 min，甩干，重复洗板3 次，末次将孔板扣于滤纸，吸干孔内残留液体；各孔加入100 μl 检测溶液B 工作液，37℃环境下孵育0.5 h；孔内废液去除，甩干，洗板5 次，步骤同上；各孔加入90 μl TMB 底物溶液，37℃环境下15 min 避光显色，各孔加入终止液50 μl，轻敲孔板混匀；检测孔无气泡，孔板底无水滴，于酶标仪450 nm 波长下测定各孔OD 值。

1.2.3 瘤体组织载脂蛋白CI 检测（免疫组化SP 法）取肿瘤组织新鲜样本，经中性甲醛（10%）固定，石蜡包埋，常规切片；置于烤箱于60℃条件下孵育60 min，避免脱片；经酒精、二甲苯脱蜡，PBS 洗涤5 min/次，共3 次；柠檬酸盐缓冲液抗原修复15 min，降至室温，经PBS 浸泡5 min/次，共3 次；室温下经H2O2（3%）孵育20 min，内源性过氧化物酶封闭，PBS 洗涤5 min/次，共3 次；加入山羊血清封闭液，50 μl/片，室温封闭0.5 h，甩干加入一抗，50 μl/片，放入湿盒，于4℃环境下过夜；采取PBS 浸泡5 min/次，共3 次；加入偶联生物素二抗，50 μl/片，于37℃环境下孵育0.5 h，经PBS 洗涤，流程同上；加入链霉卵白素（标记辣根过氧化物酶），50 μl/片，于37℃环境下孵育0.5 h，经PBS洗涤，流程同上；DAB 工作液显色，反应时间5 min，以自来水冲洗，终止显色反应；苏木素复染细胞核，50 μl/片，2 min，自来水冲洗，终止染色；经酒精梯度脱水，以二甲苯透明，采取中性树胶封片，经显微镜观察拍照。

1.3 观察指标

①比较两组血清及组织载脂蛋白CI 表达水平。②比较研究组不同疾病分期患者血清及组织载脂蛋白CI 表达水平。③分析血清及组织载脂蛋白CI 表达水平与肾母细胞瘤疾病分期的关联性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验，多重比较采用LSD-t 检验，不符合正态分布者转换为正态分布后行统计学分析；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman 进行相关性分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者载脂蛋白CI 水平的比较

研究组血清载脂蛋白CI 水平为（52.35±10.63）μg/ml，高于对照组的（32.61±9.05）μg/ml，差异有统计学意义（t=7.305，P＜0.001）；研究组的瘤体组织载脂蛋白CI 为（49.79±7.81）μg/ml。

2.2 研究组不同疾病分期患儿载脂蛋白CI 水平的比较

研究组不同疾病分期患儿血清及瘤体组织载脂蛋白CI 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。Ⅱ期患儿血清及瘤体组织载脂蛋白CI 水平高于Ⅰ期患儿，Ⅲ期患儿血清及瘤体组织载脂蛋白CI 水平高于Ⅱ期患儿，Ⅳ期患儿血清及瘤体组织载脂蛋白CI 水平高于Ⅲ期患儿，Ⅴ期患儿血清及瘤体组织载脂蛋白CI 水平高于Ⅳ期患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 研究组不同疾病分期患儿载脂蛋白CI 水平的比较（μg/ml，）

表1 研究组不同疾病分期患儿载脂蛋白CI 水平的比较（μg/ml，）

2.3 疾病分期与载脂蛋白CI 的相关性分析

血清及瘤体组织载脂蛋白CI 水平与肾母细胞瘤疾病分期呈正相关（P＜0.05）（表2）。

表2 疾病分期与载脂蛋白CI 的相关性分析

3 讨论

肾母细胞瘤为小儿群体常见肾脏恶性肿瘤类型，疾病早期缺乏特异性临床表现及症状，因此早期漏诊及误诊率较高[5-7]。同时，不同分期肾母细胞瘤患者生存期限存在显著差异，且其影响因素较多，包括疾病分期、早期诊断与治疗时机等，其中早期诊断对确保患者及早得到有效治疗、以此保证疾病治疗效果具有积极意义[8-10]。目前，临床多通过循环miRNAs、促血管生成素-2、缺氧诱导因子-1 等对肾母细胞瘤进行诊断评估，但其血清表达水平易受环境等因素影响，导致其临床应用存在局限性[11-13]。

载脂蛋白CI 在恶性肿瘤中的检测价值逐渐得到广泛关注，当前临床已经蛋白组学技术自肾母细胞瘤患者血清内提取出载脂蛋白CI，但关于其在肾母细胞瘤患儿血清内表达情况的报道研究尚未得到广泛证实[14]。载脂蛋白CI 为载脂蛋白家族中最小可溶性蛋白类型，主要于肝脏内合成，仅少部分于小肠等器官内合成，为循环系统内阳离子含量最丰富的蛋白[15]。载脂蛋白CI 可参与高密度脂蛋白与富含甘油三酯的脂蛋白的组建，通过结合于低密度脂蛋白及极低密度脂蛋白受体，发挥抑制功能。王磊等[16]研究指出，载脂蛋白CI 为肝脏生成的含83 个氨基酸残基的一种水溶性低分子蛋白质，具备体内脂质代谢调节等多种作用，且载脂蛋白CI 和多种恶性肿瘤间具有密切关联性，主要表现为在胃癌、子宫内膜癌、前列腺癌及其他恶性肿瘤中均表现为载脂蛋白CI 表达水平异常，表明载脂蛋白CI 在诸多类型恶性肿瘤中均为异常高表达状态，可能是因恶性肿瘤细胞高代谢状态对能量具备更多需求，促进机体更多地动员脂蛋白，上调血清内脂蛋白与其组成成分载脂蛋白CI 的表达，但由于载脂蛋白CI 相关的多种类型肿瘤通常发生于成年人群，而在儿童中发病率相对较低，故不影响将载脂蛋白CI 作为肾母细胞瘤重要的诊断评估标志物。

目前，关于载脂蛋白CI 在恶性肿瘤中的表达水平及检测价值已得到临床证实，如Shi等[17]研究证实，在非小细胞肺癌患者中，载脂蛋白CI 呈高表达状态，且随着疾病分期的增高，其水平呈逐渐增高趋势，故可用于疾病病情程度的评估，且其在疾病预后预测中具有较高应用价值。Kiebish等[18]研究显示，在早期前列腺恶性肿瘤、激素抵抗性前列腺恶性肿瘤中，患者载脂蛋白CI 血清表达水平呈逐渐增高状态，且自正常前列腺组织至高分化前列腺恶性肿瘤，再至低分化及激素抵抗性前列腺恶性肿瘤组织内，载脂蛋白CI蛋白表达也逐渐增高，表明在前列腺恶性肿瘤患者中，载脂蛋白CI 水平越高，则预后越差。本研究结果显示，研究组血清载脂蛋白CI 水平高于对照组，且不同疾病分期肾母细胞瘤患者血清、瘤体组织载脂蛋白CI 水平存在明显差异，经相关性分析证实两者呈正相关（P＜0.05），提示载脂蛋白CI 检测在肾母细胞瘤中存在较高应用价值，可准确用于评估疾病分期，对指导临床采取针对性治疗具有重要意义。

综上所述，肾母细胞瘤患者载脂蛋白CI 呈高表达状态，通过检测其水平可对疾病分期予以评估，可为临床制订或调整干预方案提供一定参考依据，利于保证疾病良好转归。但本研究存在一定局限性，即本研究为单中心小样本研究，因此研究结果是否存在广泛效力仍需扩大样本选取范围、增加样本量进一步探究证实。