小鼠颌下腺生后发育及三叶因子3的表达

王奕农，蔡尚烜，杨童焜，冯小宁，尉迟潇涵，韩一唯，孙梦阳，吴靖芳

(河北北方学院形态学实验室，河北北方学院,河北 张家口 075000)

三叶因子3(trefoil factor 3，TFF3)首先发现于大鼠空肠黏膜，存在于哺乳动物的多种组织细胞，常由黏液上皮细胞合成并与粘蛋白结合一起分泌[1]。TFF3具有促进黏膜上皮生长与修复、调控信号转导、促进血管生成、维持脑组织发育等作用[2]。颌下腺作为大唾液腺之一，其分泌物占唾液组分的70%，在维持口腔湿润、杀菌、初步消化食物等方面具有重要意义。人体颌下腺和小唾液腺是口腔TFF3的主要来源[3]。唾液中的TFF3有助于保护口腔黏膜[4-5]。牙龈炎和牙周炎患者唾液中TFF3浓度显著低于健康人群，牙龈蛋白酶对TFF的水解作用可能是导致慢性牙周炎患者唾液TFF减少的原因[6-7]。牙周炎局部和全身的TFF1和TFF3水平升高并参与牙周组织破坏期的宿主反应，TFF3水平或可用于指导重度牙周炎患者治疗策略选择[8-9]。啮齿类动物颌下腺能够分泌多种生物活性物质，大鼠颌下腺导管细胞中有TFF3表达[10]，但未见小鼠颌下腺生后发育及TFF3研究的报道。本实验旨在通过观察小鼠颌下腺生后发育的形态学变化及TFF3在颌下腺的表达情况，探讨其在小鼠颌下腺中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

随机选取性成熟的KM小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，雄性4只，雌性16只。器械：解剖剪、眼科剪、组织镊、ependoff微量移液器、Leica2235石蜡切片机、北京六一电泳相关设备、Tanon5200凝胶成像系统等。

试剂：硫酸铬钾、明胶、苏木精染液、伊红染液、过碘酸、Schiff试剂、兔TFF3抗体(武汉博士德生物科技有限公司)、免疫组化ABC试剂盒、预染蛋白Marker、羊抗兔IgG、ECL显色发光试剂盒(博奥森生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 取材：取健康小鼠，按照雌雄2∶1于晚18:00进行合笼饲养，次日早7:00点检查雌性小鼠阴栓，见阴栓之日起为妊娠(gestation day，GD)0 d，并将妊娠母鼠取出，隔离饲养。所有小鼠饲养环境相同，空气流通、食物充足，垫料清洁。密切观察妊娠19 d以上母鼠的生产情况，生后仔鼠记为生后(puerperal，P)1d。选择P1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31的仔鼠(雌雄不拘)为研究对象。颈椎脱臼法处死，剪开颈部迅速取出小鼠颌下腺，左侧置于Bouin’s固定液中固定24 h以上进行石蜡切片制作，厚度5μm，裱贴于涂有铬矾明胶的载玻片上；右侧置于液氮中用于Western blot实验。

1.2.2 HE染色：石蜡切片常规脱蜡、水化至自来水，苏木精复染细胞核10 min，盐酸酒精分化，温水返蓝。伊红染液染细胞质，蒸馏水冲洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.3 PAS染色：石蜡切片常规脱蜡、水化，将过碘酸滴于玻片，使之完全覆盖组织，室温氧化10～15 min，自来水冲洗5 min，将玻片置于湿盒中，Schiff试剂避光染色20 min，自来水冲洗约5 min，镜检，苏木精染液染细胞核10 min，蒸馏水清洗，温箱烘干，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.4 免疫组化：石蜡切片常规脱蜡水化，0.01M的PBS缓冲液洗涤5 min；pH6.0的枸橼酸修复液进行抗原修复；3% H2O2浸润组织20 min，以消除内源性过氧化物酶；滴加TFF3(效价1∶100)4 ℃过夜；II抗、III抗37 ℃各孵育30 min(I抗、II抗、III抗孵育结束后，均以0.01M PBS缓冲液清洗5 min×3次)，继而DAB显色，苏木精复染细胞核，常规脱水、透明、封片。

1.2.5 Western blot：①蛋白质提取试剂盒提取不同发育阶段小鼠颌下腺组织总蛋白；②根据BCA试剂盒说明测定蛋白浓度；③SDS-PAGE电泳：配制12%的分离胶、5%的浓缩胶，上样30 μg蛋白；④转膜：电泳完毕后取出凝胶，根据Maker分子量标准裁下相应位置的凝胶；PVDF膜用甲醇浸泡数秒,在转膜缓冲液中平衡5 min；按照负极→海绵→3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸→海绵→正极的顺序放置，恒压70 V转移蛋白至PVDF膜1 h后取出膜；封闭液(含5%脱脂奶粉的PBST溶液)室温封闭1 h；TFF3(1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜；PBST洗膜5 min×3次；PBST溶液按1∶5 000稀释II抗，孵育1 h；PBST洗膜5 min×3次；膜蛋白面滴加ECL发光液，天能5200化学发光成像仪成像。目的蛋白与内参照β-actin灰度值比值作为蛋白的相对含量。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 HE染色结果

小鼠颌下腺是以浆液腺泡为主的混合腺，导管包括闰管、颗粒曲管(granular convoluted tubule，GCT)、纹状管和小叶间导管。生后1 d日龄小鼠颌下腺细胞分裂增殖较为活跃，光镜可见处于有丝分裂期的细胞(图1A)，腺泡细胞和导管细胞结构和着色差别小，排列方式也较为接近。7 d腺泡细胞排列紧密，分裂象明显减少，胞核染色加深，靠近基底面，与导管细胞有较为明显的形态差别。导管细胞胞浆嗜酸性略强于腺泡细胞，导管细胞核仁明显，代谢活跃(图1B)。15 d腺泡细胞可区分胞核圆形的、基底部胞浆嗜碱性的浆液性腺泡和胞核呈扁圆形、胞质呈泡沫状的黏液性腺泡，浆液性腺泡数量多于黏液性腺泡；导管直径增加，细胞排列紧凑，细胞分界不清，核质比较大，胞核位于细胞中央，胞浆呈粉红色嗜酸性。25 d颌下腺的组织形态已基本接近成年小鼠(图1C)，腺泡细胞趋于成熟，细胞核体积进一步缩小，染色加深。导管部可见颗粒曲管结构，细胞间分界不清，胞核位于细胞中央偏向基底部，胞浆呈嗜酸性。

2.2 PAS染色结果

小鼠颌下腺腺泡细胞PAS阳性反应，而导管细胞为弱阳性或阴性。生后1 d日龄时，通过PAS染色即可清楚辨别导管细胞呈蓝色，腺泡细胞呈粉红色(图1D)。7 d日龄腺泡细胞呈深红色，阳性反应增强，导管占比升高(图1E)。15 d日龄时，腺泡细胞PAS阳性细胞增加(图1F)。

2.3 TFF3免疫组化结果

小鼠颌下腺导管细胞胞浆自1日龄开始呈TFF3弱阳性。阳性信号位于导管上皮细胞和肌上皮细胞胞浆，腺泡细胞阴性(图1G)。生后7 d颌下腺组织即可观察到TFF3聚集在导管游离缘，TFF3信号中等强度，腺泡细胞呈阴性(图1H)。15 d后小鼠下颌下腺中导管上皮细胞TFF3表达明显增强，各级导管游离面可观察到TFF3的阳性表达，大导管腔有TFF3阳性分泌物(图1I)。

图1 小鼠颌下腺生后P1、P7、P15形态学变化A～C(HE染色)、D～F(PAS染色)、G～I(IHC)400(bar=20 μm)

2.4 Western blot结果

生后1 d小鼠颌下腺组织中已表达TFF3，但含量相对较低，3～5 d组织中TFF3表达逐渐上升。7 d开始，小鼠颌下腺TFF3含量明显增加，25 d以后颌下腺组织中TFF3保持在相对稳定状态，表达水平相较于小日龄有明显提升(图2A、2B)。

注：与1～5 d比较*P<0.05,**P<0.01。

3 讨 论

本研究以生后1～31 d日龄的仔鼠颌下腺为标本，通过多种染色方法对其生后发育进行观察。1 d日龄仔鼠颌下腺中细胞体积较小，细胞分裂象多见，提示颌下腺处于生长发育旺盛阶段，PAS染色发现腺泡细胞内已开始大量合成糖蛋白，而导管内仅有少量糖蛋白存在，该时期腺泡和导管细胞胞浆的嗜色性较为接近，HE染色差别较小。7 d日龄细胞有丝分裂减少，腺泡细胞基底部胞浆嗜碱性增强，导管和腺泡在HE染色下出现较明显的差别，腺泡细胞PAS阳性反应增强，合成糖蛋白增加，与1 d日龄相比，此时颌下腺中导管所占比例增加，管径变粗。15 d左右腺泡和导管比例逐渐稳定，浆液性腺泡和黏液性腺泡区别明显，浆液性腺细胞基底部碱性颗粒累加，胞浆顶端嗜酸性增强，而黏液性腺细胞胞浆内粘蛋白含量增加，胞浆着色变浅，腺泡PAS染色阳性信号增强，提示颌下腺发育日趋成熟。仔鼠一般于21 d左右断奶，颌下腺发育成熟，在仔鼠断奶前就开始适应固体食物，上述结构变化已为积极进食奠定了基础。25 d日龄开始，仔鼠颌下腺功能已基本完善，镜下观察该时段仔鼠颌下腺HE和PAS染色切片，同成年小鼠并无明显区别，因此至25 d仔鼠颌下腺发育基本完成。25 d小鼠颌下腺HE染色切片可以观察到颗粒曲管的存在，其中颗粒曲管粗、长而弯曲，可分泌多种生物活性物质，由国内学者对小鼠颌下腺颗粒曲管上皮生长因子的免疫组化实验可知，雄性小鼠颌下腺颗粒曲管于生后20～35 d不断变粗，功能逐渐完善[11-12]，与本实验结果基本一致。

本研究免疫组织化学结果显示小鼠颌下腺组织TFF3主要表达于颌下腺导管，这与大鼠颌下腺TFF3表达部位一致[10]，而与Jagla[13]报道的人颌下腺TFF3由浆液性腺泡合成有所不同，推测可能与二者的种属不同有关。颌下腺组织中TFF3的Western blot结果显示生后1 d颌下腺导管细胞内已存在13 kD左右的TFF3条带，1～5 d颌下腺TFF3含量处于较低水平，但从7 d开始至25 d颌下腺组织内TFF3表达水平明显增加。国外学者通过蛋白质液相色谱和蛋白质组学研究发现人类唾液中TFF3存在高分子量和低分子量形式[14]。研究显示TFF3通过与受体跨膜蛋白CD147、CXCR4/CXCR7结合促进细胞迁移、抑制凋亡和失巢凋亡，对黏膜有效重建至关重要[15-16]。同时有研究表明TFF3可以通过活化PI3K/Akt通路促进胃黏膜上皮细胞增殖[17]。IHC结果显示生后7d颌下腺组织免疫组化切片中即可观察到TFF3聚集在导管游离缘，15 d即能观察到导管管腔内TFF3阳性信号增强(图I)，表明颌下腺具有外分泌TFF3的能力。有报道显示TFF3是人类唾液的重要组成成分[14]，颌下腺导管中的TFF3可同唾液一起进入口腔和胃肠道，发挥其对口腔黏膜和消化道黏膜的保护作用[10,18]。重组人三叶因子3可通过降低二胺氧化酶活性，减轻肠道损伤，从而降低肠黏膜通透性，改善严重烧伤引起的强烈肠黏膜屏障损伤[19]。小鼠从21 d开始自主觅食，逐渐脱离母乳喂养，外分泌的TFF3可以直接作用于口腔及消化道黏膜细胞表面，促进黏膜细胞的生长和修复。

本研究对小鼠颌下腺组织的生后发育进行了初步形态学观察，为今后深入研究奠定了基础。