帕勒隆尼氏假单孢菌HG-258发酵条件和培养基的优化

刘 芳，王 英，杨 陶，黄大野

(湖北省生物农药工程研究中心，湖北武汉 430064)

黄瓜是我国日常消费的主要蔬菜品种，位居保护地栽培面积第一位，在保障蔬菜周年供应中占有举足轻重的地位。2015年我国黄瓜种植面积 125.8万hm2，产量5 938 万t，均居世界首位[1-2]。猝倒病是黄瓜育苗及移栽期间的主要病害，是世界著名的毁灭性病害，可造成烂种、烂芽及幼苗猝倒。特别是在气温低、土壤湿度较大时发病严重，在温室及大田均可造成严重的危害[3-4]。一般发病率20%～50%，严重地块可达 80%以上，近年来猝倒病已成为影响黄瓜生产的首要问题。猝倒病的病原菌主要为卵菌纲瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，生产上还没有针对猝倒病的高抗品种，化学药剂仍是猝倒病防治的主要手段。但随着药剂的使用抗药性迅速出现，导致药剂失效[5]。同时，化学杀菌剂的使用会造成农药残留和环境污染，危害人畜健康。因此，开发生物活性高、对非靶标生物安全和环境相容性好的新型杀菌剂具有重要意义。

植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是一类在农业生产中具有重要应用价值的微生物[6]。帕勒隆尼氏假单孢菌(Pseudomonaspalleroniana)最早从水稻中分离并鉴定[7]，具有较为广谱的农用生物活性，包括促进蘑菇生长[8]、促进植物生长[8-9]，但也有报道P.palleroniana菌株可抑制拟南芥的生长[10]。针对黄瓜苗期猝倒病，笔者从黄瓜苗期根际土壤中分离到P.palleronianaHG-258菌株，其对黄瓜苗期猝倒病有明显的防控效果，具有开发潜力。对该菌株的生长特性、发酵条件及培养基优化等方面的研究，有助于提高该菌株的发酵水平，为该菌株的工业化生产提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试菌株帕勒隆尼氏假单孢菌(Pseudomonaspalleroniana)HG-258菌株由湖北省生物农药工程中心从黄瓜苗期根际土壤样品中分离得到并保存。

LB 培养基：胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母提取物5 g，蒸馏水 1 L，pH 7.0。基础发酵培养基：葡萄糖 10 g，蛋白胨15 g，蒸馏水 1 L，pH 7.0，500 mL 三角瓶装液量为100 mL。发酵培养基：根据需要具体配制，500 mL 三角瓶装液量为100 mL。

1.2 试验方法

1.2.1种子液制备。将斜面菌种接种1环至LB液体种子培养基中，30 ℃、180 r/min 培养 12 h。

1.2.2菌数测定。采用稀释涂布平板计数法。

1.2.3发酵培养基的优化。①碳源。分别用 10 g/L葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米粉和玉米淀粉5种碳源作为唯一碳源，基础发酵培养基中的其他组分蛋白胨含量不变，pH 7.0，接种量5%，28 ℃、180 r/min培养 32 h 后测定发酵液的菌数，确定最佳碳源。②氮源。固定碳源葡萄糖10 g/L，分别以15 g/L 鱼粉、豆粕、蛋白胨、酵母膏、花生粕、芝麻粕和玉米浆7 种氮源作为唯一氮源进行发酵培养，玉米浆用量按干物质含量折算。pH 7.0，接种量5%，28 ℃、180 r/min培养 32 h 后测定发酵液的菌数，确定最佳氮源。③正交试验。在单因素试验的基础上，以甘油和蔗糖为碳源，豆粕、酵母膏为氮源，无机盐固定为硫酸镁0.1 g/L，磷酸二氢钾0.05 g/L，设计4因素3水平正交试验(表 1)，pH 7.0，接种量5%，28 ℃、180 r/min培养 32 h 后测定发酵液的菌数。

表1 正交试验因素与水平

1.2.4发酵条件的优化。在选用最适培养基条件下，分别考察不同温度、pH、接种量、转速对HG-258菌体生长的影响。

1.2.5生长曲线。在最适培养基和最佳培养条件下摇床振荡培养 48 h。培养期间每隔 4 h 取液态样品测定菌数并涂片镜检。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的优化

2.1.1碳源。从图1可以看出，不同碳源对HG-258菌株菌体生长有不同的影响，其中甘油和蔗糖作为碳源的效果较好，发酵结束后菌数为 1.574×1010和1.682×1010CFU/mL，因此选择甘油和蔗糖为HG-258菌株发酵培养基的碳源。

图1 不同碳源对HG-258菌株生长的影响

2.1.2氮源。由图 2 可知，HG-258菌株在含有豆粕和酵母膏的培养基中菌数较高，发酵结束后菌数为 1.762×1010和1.886×1010CFU/mL，因此选择豆粕、酵母膏作为HG-258菌株发酵培养基的氮源。

图2 不同氮源对HG-258菌株生长的影响

2.1.3正交试验结果。由表2和表3可知，影响HG-258菌株发酵水平主次因素关系为蔗糖>甘油>酵母膏>豆粕，蔗糖的F为2.718，对发酵的影响最大，而豆粕对发酵的影响较小。HG-258菌株的最佳发酵培养基：蔗糖 10.0 g/L，甘油 10.0 g/L，酵母膏 30.0 g/L，豆粕 10.0 g/L，硫酸镁0.1 g/L，磷酸二氢钾0.05 g/L，此配方在pH 7.0，接种量5%，28 ℃、180 r/min条件下培养 32 h，HG-258菌株的发酵菌数可达 2.544×1010CFU/mL。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

2.2 发酵条件的优化

2.2.1温度。由图3可知，HG-258菌株在28 ℃培养条件下菌数最高，可达2.544×1010CFU/mL。

图3 不同培养温度对HG-258菌株生长的影响

2.2.2起始pH。由图4可知，HG-258菌株在培养基起始pH 7.0条件下菌数最高，可达2.526×1010CFU/mL。

图4 不同起始pH对HG-258菌株生长的影响

2.2.3接种量。由图5可知，在一定范围内，HG-258菌株发酵液中的菌数随接种量的增加而增加，但当接种量> 5% 时，菌数呈下降趋势。因为 3% 接种量和 5% 接种量菌数差别不大，从经济角度出发，在后续试验中选择3%的接种量为佳。

图5 不同接种量对HG-258菌株生长的影响

2.2.4转速。由图6可知，随着摇床转速的增加，HG-258菌株的菌数也随之增加，但200和220 r/min条件下菌数差别不大。从经济角度出发，将HG-258菌株的培养摇床转速确定为 200 r/min。

2.3 生长曲线由图7和镜检情况可知，HG-258菌株的生长规律：0～4 h 延滞期，菌数很少；4～24 h 对数生长期，菌体呈杆状，数量迅速增加，24～36 h 稳定期，32和36 h菌数相差不大，杆状菌体大量脱落形成球状菌体，32 h时98%的菌体形成整齐的球状菌体，因此32 h左右是最佳培养结束时间，36 h以后进入衰亡期。

图7 HG-258菌株的生长曲线

3 结论与讨论

对具有防病促生活性的生防微生物发酵培养基及培养条件的优化可推动生防微生物的深入评价及生防产品的开发。不同微生物菌株的营养需求不同，可通过不同的试验设计对其发酵培养基及培养条件进行优化。在假单孢菌发酵培养基筛选中，多采用蛋白胨、甘油、葡萄糖等作为发酵的碳源及氮源[11-14]。从该研究结果看，帕勒隆尼氏假单孢菌(P.palleroniana)HG-258菌株对缓效碳源，如玉米粉及玉米淀粉的利用不好，而蔗糖、葡萄糖及甘油有利于菌体的生长，这与其他的研究结果一致。在氮源利用上，HG-258菌株对花生粕、芝麻粕及玉米浆等氮源利用不好，但豆粕、酵母膏及蛋白胨等有利于菌体的生长，特别是在以豆粕为氮源的培养基中生长与在以酵母膏为氮源的培养基中生长相当，这为降低HG-258菌株发酵成本提供了可能。HG-258菌株发酵的最适温度范围较广，有利于发酵过程中温度的控制。从发酵培养基的pH对菌体生长的影响来看，pH对生长的影响较大，最适pH为7.0。接种量从1%～5%，菌数与接种量呈正相关，而随着接种量进一步上升，发酵液菌数则下降。发酵转速反映了发酵过程中的溶氧量，作为一种好气性细菌，HG-258菌株需要较高的溶氧，要采用较高的转速200～220 r/min。HG-258菌株生长较快，发酵36 h就达到了生长高峰。该研究确定了帕勒隆尼氏假单孢菌(P.palleroniana)HG-258菌株的最适培养基：蔗糖 10.0 g/L，甘油 10.0 g/L，酵母膏 30.0 g/L，豆粕 10.0 g/L，硫酸镁0.1 g/L，磷酸二氢钾0.05 g/L。对发酵条件优化确定了HG-258菌株的最佳发酵条件是初始 pH 7.0，培养温度 28 ℃，接种量 3%，转速 200 r/min 摇床振荡培养。在最佳发酵条件下，摇瓶发酵液菌数可达 2.826×1010CFU/mL，相比初始培养基及培养条件下的发酵水平提高了约1倍。所采用的培养基原料来源广泛，价格低廉易获取，为该菌株的进一步产业化开发奠定了基础。