基于网络药理学及分子对接研究石菖蒲-郁金药对治疗冠心病合并焦虑/抑郁的作用机制

张心慈,王凤荣

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)又称冠心病,是动脉粥样硬化引起冠状动脉血管狭窄或堵塞造成心肌缺血、缺氧或坏死的一种缺血性心脏病[1]。心脏冠状动脉病变引起心排血量减少,可表现为前胸压榨性疼痛或憋闷感觉,导致病人内心恐惧、担忧,进而引发焦虑[2]。同时,长期的紧张和焦虑情绪会影响心血管病病人的康复进程和生活质量[3-4]。冠心病病人的心脏症状与焦虑、抑郁等情绪变化相互影响,交织为病,此即为中医学“双心疾病”[5]。

冠心病可归属于中医的“胸痹”“真心痛”范畴,焦虑、抑郁状态可归属于中医的“郁证”“脏躁”“百合病”范畴。冠心病合并焦虑/抑郁状态的中医基本病机可为气血失调,从而导致痰饮、瘀血等主要病理产物阻滞脉络,其病性虚实夹杂,治疗应重在调肝、健脾、养心,久病迁延不愈予以补肾调治。在临床治疗方面,针对“双心疾病”,西药治疗靶点单一,很难对疾病进行全方位的干预,同时病人多难以忍受抗焦虑或抗抑郁药物的不良反应和成瘾性等。中药具备整体调节的特点,副作用小,且疗效显著。药对不仅是中药配伍的基本形式,也是方药之间的桥梁。石菖蒲、郁金药对出自《温病全书》中的菖蒲郁金汤,具有清热化痰、通窍利湿之功,主治痰热蒙蔽心包,神昏谵语之证。

王凤荣教授常运用自拟方参七解郁颗粒治疗“双心疾病”,本研究选取其中君臣石菖蒲-郁金药对,采取网络药理学方法,对石菖蒲-郁金治疗冠心病合并焦虑/抑郁状态的潜在作用靶点进行分析,对其作用机制进行系统研究。

1 资料与方法

1.1 石菖蒲-郁金活性成分的挖掘与筛选 通过中药系统药理学分析平台(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库将石菖蒲、郁金两味中药分别进行检索,筛选同时符合口服生物利用度(OB)≥30%、药物相似性(DL)≥0.18 两个条件,得到其各自的活性成分,并通过TCMSP 查找成分对应的靶点。应用UniProt(http://www.uniprot.org)数据库获得所有对应靶点信息的基因名并校正。

1.2 挖掘冠心病合并焦虑/抑郁疾病靶点 通过GeneCards(https://www.genecards.org)数据库以“coronary heart disease”“depression”“anxiety disorder”为关键词检索收集疾病相关的基因。应用Uniprot 数据库对蛋白靶点数据实施标准化处理。之后利用Venny 2.1.0 在线工具得到两者的交集靶点,绘制出韦恩图。

1.3 药物-活性成分-交集靶点网络构建与分析 采用Cytoscape 3.9.0 软件将以上所得的石菖蒲-郁金活性成分以及与疾病的交集靶点进行可视化处理,构建药物-活性成分-交集靶点相互作用网络图,并对其进行分析。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建与关键靶点的筛选 将筛选得到的交集靶点上传到STRING(https://cn.string-db.org/)数据库进行PPI 网络分析,得到相互作用网络图。将获得的数据利用R 语言软件根据Count 值排名前30 位得到关键靶点并制作柱状图。

1.5 基因本体(GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 通过Metascape 数据库对交集靶点实施GO 富集分析和KEGG 通路分析。GO 分析包括生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)。以P≤0.01 为筛选条件,按照P值降序,选取各分析结果的前10 位绘制柱状图和气泡图。

1.6 活性成分与关键靶点的分子对接验证 选取靶点连接数目前3 位的活性成分作为配体,PPI 网络中Count 值前3 位的靶点作为受体,进行分子对接。通过RCSB 数据库(http://www.rcsb.org/)下载靶点蛋白的三维晶体结构,并以pdb 格式进行保存。通过Pubchem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载候选化合物的3D 化学结构以sdf 格式保存,通过Open Babe 2.4.1 将其转换为mol2 格式,再利用AutodockTools 1.5.7 转换为pdbqt 格式文件。利用pymol 软件将靶点蛋白结构去除水分子、提取配体、确定对接box 大小和去除杂质,再利用Autodock vina 加氢、加电荷并保存为pdbqt 格式文件。利用Autodock vina进行分子对接并将结果可视化处理,以对接评分结合能来筛选结合活性较好的活性成分与靶点。

2 结 果

2.1 石菖蒲-郁金药对活性成分及其靶点筛选 通过TCMSP 数据库检索,筛选后得到石菖蒲主要化学成分4 个、郁金15 个,无重复项,共获得有效活性成分19 个,删除无对应靶点信息的活性成分后共计7 个(见表1)。经过UniProt 数据库校正后,通过转换得到石菖蒲-郁金作用靶点113 个。

表1 石菖蒲、郁金主要有效活性成分基本信息

2.2 冠心病合并焦虑/抑郁状态疾病靶点筛选 采用GeneCards 数据库,分别对冠心病、焦虑症、抑郁症的靶点进行收集,输入数据库搜索的疾病名称“coronary heart disease”“anxiety disorder”“depression”检索获得冠心病靶点7 719 个、焦虑症靶点5 592 个、抑郁症靶点12 902 个。将冠心病靶点与焦虑症靶点取交集,共计2 603 个,将冠心病靶点与抑郁症靶点取交集,共计4 535 个,整合冠心病合并焦虑/抑郁去除重复项,最终获得疾病靶点数量共计4 657 个。将药物靶点与疾病作用靶点整合,取得石菖蒲-郁金药对治疗冠心病合并焦虑/抑郁交集靶点100 个。详见图1。

图1 石菖蒲-郁金药对与冠心病合并焦虑/抑郁的韦恩图

2.3 药物-活性成分-交集靶点网络构建与分析 将得到的交集靶点,通过Cytoscape 3.9.0 软件绘制药物-活性成分-交集靶点网络图(见图2)。该网络图中包含109 个节点和151 条边,其中,正方形绿色节点代表药物,六边形蓝色节点代表活性成分,圆形红色节点代表交集靶点,形状越大、颜色越深代表其节点度值越高,每条边代表药物、活性成分与靶点之间的相互作用关系。由网络图分析可知,作用靶点较多的活性成分有山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、8-异戊烯基山奈酚(8-Isopentenylkaempferol)等。

2.4 PPI 网络构建与关键靶点的筛选 将获得的100个交集靶点上传至STRING 数据库,设置物种为“Homo sapiens”,最小互作分数值为0.9,隐藏不相关蛋白,取得相应的蛋白相互作用信息,得到PPI 网络互作图(见图3),根据Count 值获得石菖蒲-郁金治疗冠心病合并焦虑/抑郁排名前30 位的关键靶点(见图4)。

图3 疾病与药物交集靶点的PPI 网络图

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析 利用Metascape 平台对石菖蒲-郁金治疗冠心病合并焦虑/抑郁的交集靶点进行功能及通路富集分析。GO 富集分析共得到1 605 个,包括BP 1 397 个、CC 85 个和MF 123 个。其中,BP、CC、MF log(P)值降序前10 位的GO 分析结果见图5。BP 主要包括调节细胞对转化生长因子β刺激的反应(regulation of cellular response to transforming growth factor beta stimulus)、细胞周期相变的负调控(negative regulation of cell cycle phase transition)等。CC 主要包括Z 板(Z disc)、转运复合物(transporter complex)、顶端质膜(apical plasma membrane)等。MF 主要包括细胞黏附分子结合(cell adhesion molecule binding)、电子转移活性(electron transfer activity)等。

图5 石菖蒲-郁金治疗冠心病合并焦虑/抑郁的GO 分析图

KEGG 富集分析共得到信号通路292 条,根据基因数目降序选取前10 条进行KEGG 通路分析(见图6)。通路主要包括癌症通路(pathways in cancer)、丙肝通路(hepatitis C)、乙肝通路(hepatitis B)、EB 病毒感染通路(Epstein-Barr virus infection)、糖基化终末产物及其受体信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、弓形体病(toxoplasmosis)、非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease)、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)。

图6 石菖蒲-郁金治疗冠心病合并焦虑/抑郁的KEGG 富集分析图

2.6 分子对接 选取靶点连接数目前3 位的主要化学成分山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇,分别与Count 值位于前3 位的核心基因靶点视黄醇类Ⅹ受体α(RXRA)、AKT1、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)3 进行分子对接(见表2),最终得到9 组受体-配体对接结果。其中,对接评分结合能＜-4.25 kcal/mol(-17.78 kJ/mol)可认为配体与靶点之间具有结合活性,＜-5.0 kcal/mol(-20.9 kJ/mol)表明结合活性较佳,＜-7.0 kcal/mol(-29.3 kJ/mol)表明两者之间有强烈的对接活性[6]。在9 组受体-配体结果中,结合能全部小于-5.0 kcal/mol(-20.9 kJ/mol),其中,6组结合能小于-7.0 kcal/mol(-29.3 kJ/mol)。对接得分最高的为:MAPK3-β-谷甾醇,分值为-10.1 kcal/mol(-42.3 kJ/mol);对接得分最低的为AKT1-柚皮素,分值为-5.5 kcal/mol(-23.0 kJ/mol)。这表明所筛选的潜在主要化合物与核心基因靶点之间具有较好的结合活性。对接结果可为今后进一步开展相关中药及成分的实验筛选设计提供数据支撑,分子对接结果见图7。

表2 主要活性成分与核心靶点结合能 单位:kcal/mol

图7 主要活性成分与核心靶点分子对接结果

3 讨 论

当前冠心病是导致全球心血管病人死亡的主要原因之一,且发病人群明显呈年轻化趋势,严重威胁人类的身体健康。冠心病病人常常伴发焦虑、抑郁等不良情绪,影响病人的生活质量及疾病的远期预后,由此,西医提出“双心医学”模式,不仅需要治疗心血管疾病,更需要关注病人的心理状况。但是针对“双心疾病”,西药治疗靶点单一,且病人多难以忍受应用传统抗焦虑、抗抑郁药物的不良反应,故远期疗效较差。中药治疗“双心疾病”具有整体调节的特点,既有多成分、多靶点的优势,且副作用小、疗效显著。

药对是中药复方中最常见的配伍形式。石菖蒲和郁金配伍在临床应用十分广泛。石菖蒲,《神农本草经》言其“主风寒湿痹,咳逆上气,开心孔,补五脏”[7]。其味辛、苦,性微温,归心、肝、脾经[8]。具备开窍豁痰、醒神益智、化湿开胃等功效,主治痰闭神昏之证。郁金,《本草经疏》曰:“郁金为血中之气药”,其味辛、苦,性寒,归肝、心、肺经,具有活血止痛、行气解郁、清心凉血等功效,主治气滞血瘀诸痛证[9]。石菖蒲重在开窍,郁金重在解郁,二药相配为伍,一温一寒,一开一清,互相促进,祛热利湿,涤痰宣窍,活血化瘀,疏肝理气,使气机顺而解郁,痰浊去而机窍开,化瘀而气血通,神志自可清明[10]。现代研究证实,石菖蒲可调节人体神经和心血管系统,对神经系统的作用主要体现在保护神经细胞,兴奋与抑制的双向调节[11-12];对心血管系统的作用主要反映在降低血压、防止异位起搏点、减少心律失常[12-13]。郁金所含的姜黄二酮有明显的中枢神经抑制作用[14-15]。

本研究结果可知,石菖蒲-郁金药对主要通过重要的化合物山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇、8-异戊烯基山柰酚等来发挥作用。有研究表明,山奈酚可以通过沉默调节因子1 介导的线粒体途径,显著增加Bcl-2 的表达,起到对缺氧心肌细胞的保护,同时,山奈酚可以有效降低血管炎症反应,具有抑制动脉粥样硬化发生的潜在功能[16]。通过实验验证了山奈酚具有抗大鼠抑郁的作用,能提高抑郁症大鼠脑内5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NA)水平[17]。有研究证明了柚皮素对动脉粥样硬化进展具有抑制作用[18]。柚皮素通过调节活性氧(ROS)水平、雌激素相关途径和线粒体钾通道对心肌细胞衰老损伤具有潜在的保护作用[19]。β-谷甾醇可通过增强抗氧化防御系统并有效降低血清胆固醇水平发挥心血管保护作用[20]。8-异戊烯基山奈酚拥有广泛的生物活性,具有较强的心血管保护作用[21],其脂溶性比山奈酚大,更易透过血脑屏障,有利于其发挥抗抑郁的效果,有待后续的药理实验验证[22]。

本研究PPI 网络表明,RXRA、AKT1、MAPK3、转录因子AP-1(JUN)、MAPK1、RELA 原癌基因(RELA)、雌激素受体1(ESR1)、MAPK14、细胞色素P450 1A1(CYP1A1)等是石菖蒲-郁金治疗冠心病合并焦虑/抑郁的关键靶点。其中,AKT1 通过一系列下游底物来调节机体代谢、细胞存活、生长和血管生成过程[23]。免疫炎症反应与神经细胞受损、凋亡在冠心病、抑郁症和焦虑症的发生发展中起着关键作用。MAPK1 作为炎症常用通路中的一员为重要的炎症评价指标,与炎症的严重程度有密切关系[24],可参与冠心病的炎性反应,还可影响冠心病的脂代谢和凝血功能[25]。研究表明,JUN 在炎症与细胞凋亡等应激过程中发挥重要作用[26]。

GO 与KEGG 分析结果显示,靶点基因主要富集在调节细胞对转化生长因子β刺激的反应、细胞周期相变的负调控、细胞形态发生参与神经元分化等生物过程以及PI3K-AKT 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等信号通路。PI3K-AKT 信号通路是生物体中重要的信号传导途径,磷酸化的AKT 可以激活内皮型一氧化氮合酶和热休克蛋白,发挥保护心肌的作用[27]。研究表明,缺血预处理刺激可以激活心肌细胞中的PI3K/AKT 信号通路,从而发挥减轻细胞凋亡、消除细胞内ROS 种类、保护线粒体功能等作用[28]。PI3K-AKT 信号通路高表达可有效调控海马神经元凋亡、再生,影响海马神经突触的可塑性,进而起到抗抑郁的作用[29-30]。肿瘤坏死因子信号通路可促使促炎性细胞因子、趋化因子、生长因子等基因的表达来放大炎症反应和免疫效应[31]。流体剪切应力是血液在血管壁内皮表面产生的摩擦力,在血管生物学中起中心作用,有助于动脉粥样硬化的进展[32]。

分子对接结果显示,核心成分山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇与核心蛋白RXRA、AKT1、MAPK3 的结合能均小于-5.0 kcal/mol,特别是柚皮素、β-谷甾醇与RXRA、MAPK3 靶点之间具有较好的结合力。说明核心成分能与核心蛋白结合起效,并通过激活或抑制核心蛋白的相关通路,从而达到治疗冠心病合并抑郁/焦虑状态的作用。

综上所述,本研究初步预测了石菖蒲-郁金治疗冠心病合并抑郁/焦虑状态的活性成分-核心靶点作用机制,分析了核心靶点的功能及相关的信号通路,并通过分子对接验证了化合物与靶点之间的结合活性。揭示了石菖蒲-郁金通过多成分、多靶点和多途径治疗冠心病合并抑郁/焦虑的物质基础和作用机制,为石菖蒲-郁金药对的开发利用提供了理论基础和科学依据。