基于网络药理学的宽胸气雾剂改善冠状动脉慢血流作用机制研究

许振宇,程可爱,程劲松,王胜煌

冠状动脉慢血流(coronary slow flow,CSF)是一种特定的血管造影现象,主要表现为在排除明显狭窄、瘤样扩张和痉挛等情况下,冠状动脉出现前向血流迟缓的现象[1]。近年来,随着冠状动脉造影技术的普及应用,临床上胸痛病人中CSF 的检出率为5%～7%,且呈逐年递增趋势[2]。研究发现大约80%的CSF 病人可出现反复发作的胸痛症状,而且部分病人病情恶化,可发生心肌梗死甚至猝死等心血管不良事件,严重影响病人的生命质量[3]。因此,CSF 已被认为是一种需要积极治疗的冠状动脉疾病表型[4]。遗憾的是,该病虽然已被发现多年,但现阶段临床上尚无有确切疗效的治疗方案[5-6],所以进一步挖掘具有潜在治疗作用的药物刻不容缓。CSF 是西医诊断,中医辨证后多将此证归属于胸痹症范畴[7]。目前中医药已经作为防治胸痹症的重要手段[8],其中,宽胸气雾剂作为芳香温通类创新性中成药,由国医大师陈可冀院士在古方《集验方》中“哭来笑去散”的基础上进一步精制研发而成[9]。近年来已广泛应用于各型胸痹症的治疗中,效果确切,特别是对心绞痛急性发作的缓解方面显示出独特优势[8]。并且有研究发现宽胸气雾剂对于CSF 病人的冠状动脉血流有一定的改善作用[10],因此值得进一步探究。但由于药物的效应成分较多,潜在的干预途径较为复杂,受限于各种因素,目前宽胸气雾剂改善CSF 的可能作用机制尚不明确。

网络药理学是近年来新兴的研究中药复方制剂的一种新策略[11],该方法可以从局部到全局多维度地探索药物和疾病之间的相互关联,这与中医辨证中“整体观”的治疗理念十分契合[12-13]。目前国内外尚无应用网络药理学探究宽胸气雾剂改善CSF 作用机制的文献报道。故本研究首次运用网络药理学的策略,构建“药物-疾病-靶点-机制”的多元化网络结构,分析宽胸气雾剂改善CSF 的相关效应成分、核心靶点等,并借助富集分析,初步预测相关药理作用机制,从而为下一步的实验研究与临床实践提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 宽胸气雾剂活性成分筛选及作用靶点预测 结合既往研究报道[14],确定宽胸气雾剂中细辛油、檀香油、高良姜油和荜茇油中挥发性的活性化合物。同时利用本草组鉴数据库(http://herb.ac.cn/),设定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)阈值≥30%、类药性(drug-likeness,DL)阈值≥0.18,筛选出冰片的活性化合物。进一步应用 PubChem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取活性化合物所对应的代谢物结构(Canonical SMILES),再通过TargetNet数据库(http://targetnet.scbdd.com/)设置曲线下面积(area under the curve,AUC)≥0.80,输入上述化合物的Canonical SMILES,最终获取相对应的作用靶点。

1.2 CSF 疾病靶点 以“coronary slow flow”为关键词检索GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/)和OMIN 数据库(https://omim.org/)。然后将数据库检索得到的人源性靶点进行汇总去重后,建立CSF 匹配的靶点。

1.3 构建化合物-靶点网络 将宽胸气雾剂中的活性化合物及对应的作用靶点输入 Cytoscape 软件(Version3.7.2,http://www.cytoscape.org)进行化合物-靶点网络的构建,以进一步明确活性化合物与作用靶点之间的关联性,并筛选出主要的活性化合物。

1.4 药物-疾病共有靶点筛选 将药物的作用靶点和疾病的匹配靶点输入韦恩图制作软件,获取共有靶点并进一步分析。

1.5 蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络及核心靶点筛选 将药物-疾病共有靶点上传至STRING 数据库(https://cn.string-db.org/),物种限定为人源性,设置中位置信度评分为0.40,获取PPI 网络。使用将Cytoscape 软件中对PPI 网络进行聚类分析和可视化处理。同时利用软件中的Cytohubba 算法进一步筛选核心靶点。

1.6 富集分析 应用Metascape 数据库(https://metascape.org/)进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的富集分析,探索宽胸气雾剂改善CSF 潜在的生物过程和信号通路等。将共有靶点上传至数据库,物种限定为人源性,设置最小交集为3、P截断值为0.01、最小富集为1.5 共3 个条件后进行富集分析。按照-LogPvalue 排序,获取GO 富集分析中生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组成(cellular component,CC)及KEGG 富集分析中处于前列的信号通路。同时使用R3.6.3 软件对结果进行可视化输出。

2 结 果

2.1 宽胸气雾剂中活性化合物的确定 依托既往研究提供的宽胸气雾剂气相质谱(GC-MS)检测信息[14]和HERB 数据库检索的结果,共获得活性化合物共39个,其中,细辛油10 个,檀香油8 个,高良姜油12 个,荜茇油7 个,冰片3 个。石竹烯(C27)是高良姜油和荜茇油的共同化合物。宽胸气雾剂中活性化合物的具体信息见表1。

表1 宽胸气雾剂活性化合物信息表

2.2 活性化合物-作用靶点网络构建 经过TargetNet 数据库检索汇总和去重,共获得39 个活性化合物及对应的作用靶点171 个,网络关系见图1,其中,紫色节点代表细辛油的活性化合物,粉色节点代表檀香油的活性化合物,橙色节点代表高良姜油的活性化合物,红色节点代表荜茇油活性化合物,深绿色节点代表高良姜油和荜茇油共有的活性化合物,黄绿色节点代表冰片的活性化合物,湖蓝色节点代表对应的作用靶点。进一步分析节点度值,其中,β-蒎烯(C1)、榄香素(C10)、檀香醇(C12)、α红没药醇(C13)、桉油精(C22)、石竹烯(C27)、龙脑酯(C38)等活性化合物在各自药物成分中具有较高的度值,因此,推测可能是宽胸气雾剂发挥相关药效作用的主要化合物。这一结果体现了宽胸气雾剂多活性成分和多作用靶点的特性。

图1 宽胸气雾剂活性化合物-作用靶点网络图

2.3 CSF 疾病靶点查找和共有靶点筛选 通过Genecards 数据库检索出CSF 相关靶点641 个,OMIN 数据库获取到82 个。经过合并删重后共得到CSF 匹配的靶点共699 个,进一步将699 个疾病靶点和171 个活性化合物对应的作用靶点输入韦恩图制作软件,最终获得36 个共有靶点。详见图2。

图2 药物-疾病共有靶点韦恩图

2.4 PPI 网络构建及核心靶点筛选 应用STRING数据库构建 PPI 网络后获取相关PPI 信息,输入Cytoscape 软件进行图像可视化(见图3A)。图中节点大小和颜色根据度值调整,越大、颜色越亮代表度值越大,线段粗细根据互作评分调整,越粗代表互作评分越高。然后根据Cytohubba 算法进一步筛选出核心靶点(MCC 排名前10 位),分别是白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)、热休克蛋白90-AA1(HSP90AA1)、表皮生长因子受体(EGFR)、雌激素受体1(ESR1)、核受体亚家族3C 组成员1(NR3C1)、环加氧酶2(PTGS2)、雄激素受体(AR)、DNA 甲基转移酶1(DNMT1)和多药耐药蛋白1(ABCB1),详见图3B。结果显示,这些靶点在网络调控中起着关键作用,推测可能是宽胸气雾剂改善CSF 的核心靶点。

图3 PPI 网络图和核心靶点

2.5 GO 富集分析与KEGG 富集分析 结果显示,GO 富集分析共有588 个条目,其中,生物过程条目518 个,分子功能条目46 个,细胞组分条目24 个。生物过程主要包括炎症反应调节、蛋白磷酸化的正向调节、细胞因子生成正向调节、小分子代谢过程正向调节、离子转运调节等;分子功能主要包括丝氨酸水解酶活性、核受体活性、一氧化氮合酶活性、生长因子受体结合等,并且参与了细胞中膜筏、膜被膜内腔、细胞质区域、囊腔等细胞组分组成。详见图4。KEGG 富集信号通路主要涉及白细胞介素17 信号通路、松弛素信号通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G 信号通路、环磷酸腺苷信号通路和细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路等。详见图5。上述结果直观展示了宽胸气雾剂中的有效成分在改善CSF中具有多干预途径和作用机制的特征。

图4 宽胸气雾剂改善CSF 的GO 富集分析

图5 宽胸气雾剂改善CSF 的KEGG 富集分析

3 讨 论

除外阻塞性病变所导致冠状动脉严重狭窄引起的心肌缺血外,近年来,CSF 在其中的发生率逐年上升。CSF 病人胸痛频发,可出现心力衰竭、心肌梗死等情况,甚至并发猝死等致死性急症[15]。目前研究认为CSF 的发病机制复杂,可能涉及冠状动脉微循环障碍、内皮功能异常、炎症反应等多个病理生理过程[4]。由于相关干预靶点仍不明确,因此,现阶段临床上尚缺乏有效治疗CSF 的西医药物。

CSF 是西医学名称,中医辨证多认为此证多系心脉不通、血脉不通,因而属于胸痹症范畴,进而认为芳香温通类中药可用于治疗CSF[7]。宽胸气雾剂作为芳香温通类中成药的典范,全方具有温通散寒、开窍止痛之功效,近年来已成功应用于心绞痛病人的治疗中。相关研究显示宽胸气雾剂缓解心绞痛发作的临床疗效与国产硝酸甘油片相似[16],并且其对CSF 病人有潜在的治疗作用[10]。但宽胸气雾剂治疗CSF 的效应成分、作用靶点和机制等仍不明确。因此,本研究运用网络药理学方法成功构建了药物-疾病-靶点-机制的多维网络,初步阐明了相关作用途径,从而为更深层次的探究确切机制指明了方向。本研究显示,宽胸气雾剂的活性成分对应的作用靶点171 个,与CSF 相关的疾病靶点699 个。结果提示,β-蒎烯、榄香素、α红没药醇、檀香醇、桉油精、石竹烯、龙脑酯等可能为宽胸气雾剂中发挥效应的重要活性成分。文献表明,β-蒎烯是单萜类物质的代表,具有抗氧化、抗炎和镇痛等广泛的药理学活性[17]。而α红没药醇是一种不饱和单环倍半萜醇,被称为世界上“使用最多的草药成分”之一,具有的抗氧化机制主要与降低活性氧(ROS)/活性氮(RNS)活性和增强超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等有关;此外还通过降低TNFα、IL6 和一氧化氮合酶(NOS)的活性,抑制NF-κB 的激活等发挥抗炎的功效[18]。同时研究认为石竹烯能够减少IL6 和NF-κB等促炎介质,从而改善以炎症损伤和氧化应激为特征的血管病变的慢性病理过程[19]。

在药物-疾病共有靶点中,IL6、TNF、HSP90AA1、ESR1、NR3C1 和PTGS2 等被认为是宽胸气雾剂改善CSF 的核心靶点。研究表明TNF 和IL6 等炎症介质可导致血管稳态失衡和内皮功能障碍,从而促进CSF的发生和发展[20-21]。HSP90AA1 是近来发现的可导致心肌缺血的致病靶点,而且与已知的其他冠心病致病基因共享生物学功能和病理途径等[22]。PTGS2 则被证明和冠状动脉血流和内皮功能等息息相关[23]。因此推测宽胸气雾剂中的有效成分可能主要是通过作用于上述多个核心靶点起到改善CSF 的效应。

进一步的富集分析提示宽胸气雾剂改善CSF 的作用主要与炎症反应调节、蛋白磷酸化调节、细胞因子生成调节和小分子代谢调节等生物学过程相关。在KEGG 富集分析中,可以发现核心靶点高度富集在松弛素信号通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G 信号通路、NF-κB 信号通路等通路中。目前研究证实松弛素信号通路对心血管系统可产生多效性作用,其中,以引起血管的舒张效应最为直接,同时还可抑制氧化应激和炎症反应诱发的损伤,对心肌细胞提供保护作用[24]。cGMP-PKG 信号通路则可调节血管内皮细胞内异常酸碱度的恢复速度,加快Ca2+内流和恢复线粒体的通透性,从而对心肌细胞的活性起到改善作用[25]。同时NF-κB 信号通路与氧化应激和炎症反应等因素密切相关,而这些因素已被认为和CSF 的发病密切相关,已有研究表明CSF 病人外周血中NF-κB 的表达水平明显高于正常人群,因此,调控NF-κB 信号通路已被认为是CSF 的未来治疗方向之一[26]。结合CSF 的可能发病机制,富集分析结果充分表明了运用网络药理学方法对初步预测宽胸气雾剂改善CSF 作用机制的可靠性。

在前期工作的基础上[27],通过对上述作用靶点和信号通路方面的分析发现,宽胸气雾剂改善CSF 过程中存在着复杂的交互作用,药物中各有效成分相互配伍,通过TNF、IL6、HSP90AA1、PTGS2 等蛋白作用,共同干预炎症反应调节、蛋白磷酸化调节、细胞因子生成调节等生物学过程,并通过调控血管舒张、炎症反应、氧化应激、血管内皮功能等信号通路,发挥舒张血管、抗炎、抗氧化应激、舒张血管和恢复血管内皮细胞稳态等作用。本研究为宽胸气雾剂治疗CSF 的进一步研究提供了有益的参考,也为下一步的药理机制的深入研究指明了方向。但应该认识到,这仅仅是一种理论预测,是聚焦于分子靶点和信号通路层面进行的初步探讨。根据研究结果提示,并结合其他研究,展开相关验证工作才能更为详实地阐明宽胸气雾剂改善CSF的确切机制。

4 小 结

通过网络药理学分析发现宽胸气雾剂改善CSF具有多靶点和多途径的特点。并预测了相关的可能机制,为今后进一步的基础实验提供了参考和理论依据。