PCSK9 基因E670G 位点多态性与冠心病及血脂水平的相关性研究

曾圆圆,赵 静,沈晓旭

冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞,导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病,简称冠心病(coronary heart disease,CHD)。冠心病的发病机制复杂,目前尚未完全研究清楚。流行病学调查结果显示,在冠心病众多危险因素中,脂质代谢紊乱是冠心病发生和发展的重要一环[1]。人枯草溶菌素转化酶(PCSK)9 基因功能获得性突变会导致机体血脂代谢紊乱,血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高,增加冠心病风险[2]。本研究探讨PCSK9 最常见的功能获得性突变位点E670G 位点的多态性与冠心病和血脂水平的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究以北京中医药大学东直门医院心血管一区和冠心病监护病房(CCU)为病例来源地。选取2021 年1 月—2022 年2 月住院病人99 例,其中,经冠状动脉造影或既往病史可明确诊断为冠心病者作为病例组,选取同期住院病人,经冠状动脉造影或既往病史明确不符合冠心病诊断标准者作为对照组。冠心病诊断参考《冠心病合理用药指南(第二版)》中对于冠心病的诊断标准[3]。并根据《冠心病痰瘀互结证宏观诊断标准研究》[4]对病例组病人进行辨证,分为痰瘀互结证和非痰瘀互结证。排除标准:有恶性肿瘤、血液系统疾病或者有免疫功能缺陷者;合并能够引起体内激素变化的疾病,如垂体瘤、甲状腺功能障碍、肾上腺素瘤、库欣综合征等;肝肾功能严重异常者;妊娠或哺乳期妇女。最终纳入病例组71 例(男47 例,女24 例)、对照组28 例(男20 例,女8 例)。病人具体纳入流程见图1。本研究向所有入选病人告知参与本研究所需要承担的风险及获益情况,并通过北京中医药大学东直门医院伦理审查委员会审查批准。

图1 技术路线图

1.2 临床资料收集及血清采集 所有病人利用病例记录表(Case Record Form,CRF)记录病人的基本信息以备后续分析使用。在病人空腹8 h 后晨起抽取静脉血5 mL 置于EDTA 抗凝管中,混匀后置于-80 ℃冰箱保存以备后续提取DNA。

1.3 外周血PCSK9基因E670G位点基因型检测 首先利用组织DNA 提取试剂盒(D Neasy Blood & Tissue Kit)提取DNA。再利用大连宝生物技术有限公司合成PCSK9基因E670G 位点引物(E670G-F GAGATACACGGTTGTGTCCCAA;E670G-RT GAGAGAGGGACAAGTCGGAA)进行基因组PCR 扩增。具体PCR 反应条件为:94 ℃预变性5 min,然后进行35 个循环(94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s),然后再进行72 ℃延伸7 min。反应完成后的PCR 产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收。最后取纯化后的 PCR 产物,使用测序仪ABI3730-XL 进行DNA 测序。

1.4 血脂指标检测 血脂指标为病人入院常规检查项目,检测由东直门医院检验科生化室完成,利用CRF 表记录病人的血脂信息。

1.5 统计学处理

1.5.1 一般资料分析 采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据处理,符合正态分布的定量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较方差齐者采用t检验,方差不齐者采用校正t检验。不符合正态分布的定量资料则以中位数和四分位数[M(P25,P75)]表示,两组间比较采用非参数检验(Mann-WhitneyU检验)。定性资料以百分比(%)表示,两组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.5.2 Hardy-Weinberg 平衡检验 应用Pearsonχ2检验分析PCSK9 E670G 基因型以及等位基因频率的分布是否满足Hardy-Weinberg 平衡定律,以P＞0.05表示样本具备群体代表性。

2 结 果

2.1 病例组与对照组临床资料比较 病例组与对照组性别分布差异无统计学意义(P＞0.05);两组年龄比较差异有统计学意义(P＜0.001);两组吸烟史、饮酒史、糖尿病比较差异均无统计学意义(P＞0.05),但病例组高血压比例高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);病例组冠心病家族史比例高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 病例组与对照组临床资料比较

2.2 病例组与对照组PCSK9 基因E670G 位点基因型与等位基因频率分布

2.2.1 两组PCSK9 基因E670G 位点多态性及测序结果 E670G 位点A 等位基因为野生型,G 等位基因为突变型。经过基因测序发现,本研究中的99 例血样本中PCSK9 基因E670G 位点有AA、AG 两种基因类型。其序列峰图见图2、图3。

图2 PCSK9 基因E670G 位点AG 型多态性序列

图3 PCSK9 基因E670G 位点AA 型多态性序列

2.2.2 Hardy-Weinberg 平衡检验 经过Hardy-Weinberg遗传平衡检验,两组PCSK9 基因E670G 位点基因型的分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡(P＞0.05),表明所有参与研究人员来自同一孟德尔人群,群体代表性良好。详见表2。

表2 PCSK9 基因E670G Hardy-Weinberg遗传规律检验结果 单位:例(%)

2.2.3 两组PCSK9 基因E670G 位点基因型与等位基因频率分布 基因测序发现PCSK9 基因E670G 位点有AA、AG 两种基因类型,两种基因型及等位基因在病例组与对照组的分布情况见表3。病例组基因型AA、AG 的例数依次为60 例(84.5%)、11 例(15.5%);对照组基因型AA、AG 的例数依次为22 例(78.6%)、6例(21.4%)。经检验病例组和对照组PCSK9 基因E670G 位点的AA、AG 基因型频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。病例组等位基因A、G 的例数依次为131 例(92.3%)、11 例(7.7%);对照组等位基因A、G的例数依次为50 例(89.3%)、6 例(10.7%)。经检验两组A、G等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。

表3 PCSK9 基因E670G 基因型及等位基因频率分布情况 单位:例(%)

2.3 病例组E670G 位点不同基因型血脂水平比较AA 型和AG 型病人总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、LDL-C 水平方面差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中,AA 型病人HDL-C 中位数为1.15 mmol/L,高于AG 型病人(0.98 mmol/L),但AG 型 病 人TC、TG、LDL-C水 平均高于AA 型 病 人,差异均有统计学意义(P＜0.05)。详见表4。

表4 病例组PCSK9 E670G 位点不同基因型血脂水平比较 单位:mmol/L

2.4 对照组E670G 位点不同基因型血脂水平比较对照组AA 型和AG 型之间TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。详见表5。

表5 对照组PCSK9 E670G 位点不同基因型血脂水平比较 单位:mmol/L

2.5 病例组痰瘀互结证与非痰瘀互结证血脂水平比较 痰瘀互结证组与非痰瘀互结证组TC、TG、LDL-C水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。但两组HDL-C 水平比较差异有统计学意义(P＜0.05)。其中,痰瘀互结证病人HDL-C 水平中位数为0.98 mmol/L,低于非痰瘀互结证病人(1.18 mmol/L)。详见表6。

表6 病例组不同证型血脂水平比较 单位:mmol/L

2.6 病例组不同证型PCSK9 基因E670G 位点基因型比较 基于以上结果可知,痰瘀互结证和非痰瘀互结证病人HDL-C 水平差异有统计学意义,而病例组HDL-C 水平在PCSK9 基因E670G 位点AA 型和AG型之间差异也有统计学意义,为了进一步探索冠心病证型与E670G 位点基因型之间的关系,经χ2检验,两种证型基因型分布差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表7。

表7 病例组不同证型PCSK9 基因E670G 位点基因型比较 单位:例(%)

3 讨 论

冠心病的发病机制复杂,现有研究认为,冠心病是个人遗传因素、生活行为方式和环境因素相互作用而引起的复杂性遗传性疾病。本研究中,冠心病病人冠心病家族史比例高于对照组,这也证实了遗传因素与冠心病的发病密切相关。PCSK9 由Seidah 等[5]于2003 年首次在小脑和端脑脑细胞中发现,为前蛋白转化酶(proprotein convertase,PC)家族的第9 个成员。PCSK9 基因突变可以导致其编码蛋白的功能发生改变,不同的突变类型导致血液中的胆固醇水平呈现完全相反的变化,与冠心病的发生密切相关。其中,E670G 是目前已知的功能获得性突变位点之一,也是目前在PCSK9 基因多态性与血脂水平相关性中研究最多的位点,诸多研究也证实了PCSK9 基因E670G与冠心病不同程度相关[2,6-9]。本研究证实,病例组AA基因型病人HDL-C 水平高于AG 基因型病人,但AG基因型病人TC、TG、LDL-C 水平高于AA 基因型病人。王梅等[10]也认为PCSK9 与LDL-C、载脂蛋白B(ApoB)水平呈正相关。单雪峰等[11]针对新疆维吾尔族人的研究表明,冠心病病人PCSK9 基因E670G 多态性与TC、LDL-C 水平升高相关。深入到机制层面,可能与E670G 位点的突变能够增加PCSK9 的功能,血清PCSK9 水平异常增高相关。PCSK9 基因编码一种酶,该酶已经被证明参与降解细胞溶酶体中的低密度脂蛋白胆固醇受体(LDL-R),并阻止其循环到肝细胞表面。因此,PCSK9 的功能获得性突变会导致LDL-R降解增加,细胞表面受体数量减少,进而导致机体血脂代谢紊乱,血清LDL-C 水平升高,而高水平的LDL-C和冠心病风险增加有关。另有研究表明PCSK9 也可以不通过血脂直接作用于血管内皮,促进动脉粥样硬化的发生[12]。其机制可能与泡沫细胞形成[13]、诱发血管炎症[14]、诱导血管内皮细胞和巨噬细胞凋亡[15]、促进血管平滑肌细胞分化[16]等相关。这些新机制的发现为PCSK9抑制剂防治动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)提供了理论依据,也是目前降脂治疗的新方向。

关于PCSK9 基因多态性与心血管疾病的相关性研究也有很多,本研究中病例组和对照组基因型及等位基因分布差异均无统计学意义,这与其他相关研究的结果[11]并不一致,张楠等[17]采用Logistic 回归分析校正了性别、年龄、体质指数等危险因素后发现G 等位基因的个体发生冠心病的风险高于A 等位基因个体。杨文艳等[2]也证实老年冠心病病人PCSK9 基因E670G 位点存在A 向G 的基因突变,AG 和GG 突变基因型是冠心病的危险基因型。但也有与本研究相似结论认为PCSK9 基因E670G 多态性与冠心病发病无关[8]。或许一项综合多个研究、样本量较大的Meta 分析[18]结果更能说明问题:无论是在亚洲人群还是高加索人群中,PCSK9 基因E670G 多态性均与冠心病相关,漏斗图未发现明显的发表性偏倚。不同的研究呈现完全相反的结果,考虑可能与PCSK9 基因的遗传规律相关,有研究表明PCSK9 基因的突变受到性别[19]、种族[20-21]甚至地区[22]等因素的影响。因此,PCSK9 基因多态性与冠心病关系仍需要大样本的临床研究来验证。

PCSK9 基因多态性与冠心病中医证型之间的相关性鲜见报道。本研究结果显示,AA、AG 基因型在冠心病痰瘀互结证和非痰瘀互结证之间的分布差异无统计学意义,但两证型之间HDL-C 水平存在差异,也许能够为痰瘀互结证的识别提供微观依据,具体机制仍有待进一步探讨。