基于高效液相色谱指纹图谱结合PLS-DA 的肝复康丸质量控制

苏 若，李桂女

（1. 海南医学院第二附属医院，海南 海口 570102； 2. 海南医学院第一附属医院，海南 海口 570100）

肝复康丸是由五味子、太子参、白花蛇舌草加工而成的复方丸剂，具有收敛、益气、解毒、降低转氨酶的功效，常用于急慢性肝炎、早期肝硬化、肝功能不良等症［1］。《中华人民共和国卫生部药品标准 中药成方制剂（第七册）》WS3-B-1146-92 中仅采用薄层色谱法对五味子、太子参、白花蛇舌草做了定性鉴别，以及检查丸剂通则项下相关项目［1］。文献［2 - 3］也仅对五味子单味药材中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等成分做了方法学研究，方法专属性低，无法全面、准确地评价肝复康丸的质量。指纹图谱以高效液相色谱（HPLC）法为分析手段，与指标成分定量分析相结合，用于评价中药制剂质量的整体性和稳定性［4］。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）法是通过主成分分析（PCA）结合统计软件，实现分类和筛选差异标志物的目的［5］。中药指纹图谱结合 PLS - DA 和PCA 等化学模式识别技术具有直观性及预测性等特点，已广泛应用于中药质量的控制和评价［6-7］。本研究中采用HPLC 法建立了肝复康丸的指纹图谱，并指认出其中11种成分，同时结合PLS- DA 分析了4 个生产厂家的16 批样品，为肝复康丸的质量评价提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；XS525型电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团，精度为0.01 mg）；KQ-500DBG型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为450 W，频率为40 kHz）；QYSW-30A型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

五味子醇甲对照品（批号为110957-202025，含量为99.5%），五味子酯甲对照品（批号为111549 -202006，含量为95.9%），五味子甲素对照品（批号为110763 - 202115，含量为99.1%），五味子乙素对照品（批号为110767-202013，含量为99.6%），槲皮素对照品（批号为100181-202110，含量为99.5%），山柰素对照品（批号为110861 - 202117，含量为95.2%），4 - 香豆酸对照品（批号为112057-202009，含量为99.3%），阿魏酸对照品（批号为110783 - 202111，含量为98.7%），均购自中国食品药品检定研究院；太子参环肽B对照品（批号为200511，含量≥98.1%），车叶草苷对照品（批号为191218，含量≥98.0%），去乙酰车叶草酸酐对照品（批号为1911018，含量≥96.8%），均购自四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯；肝复康丸为市售，其相关信息见表1。

表1 肝复康丸样品信息、生产厂家与规格Tab.1 Information，manufacturers and specifications of Ganfukang Pills samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件［8-10］与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Ecilipse C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%醋酸溶液（B），梯度洗脱（程序见表2）；流速：0.95 mL/min；检测波长：203 nm（太子参环肽B），238 nm（车叶草苷和去乙酰车叶草酸酐），254 nm（五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素），320 nm（阿魏酸和4-香豆酸），369 nm（槲皮素和山柰素）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，11 个成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，对称因子为0.96～1.06，表明系统适用性良好。

表2 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.2 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.2 溶液制备

分别取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、车叶草苷、去乙酰车叶草苷酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰素、阿魏酸、4-香豆酸对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解成质量浓度分别为182.7，236.7，218.3，200.8，240.2，366.8，147.2，198.5，201.2，421.5，202.9 μg/mL 的混合对照品溶液。分别取 16 批样品，每批5 袋，研细，混匀，取2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85%甲醇50 mL，密塞，静置1 h，称定质量，室温超声提取（功率为450 W，频率为40 kHz）40 min，放冷至室温，再次称定质量，用85%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，以车叶草苷（14号峰）为参照。结果26 个共有峰相对保留时间的RSD为0.14%～0.54%（n=6），相对峰面积的RSD为0.28%～0.97%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为A3），按2.2 项下方法制备供试品溶液，室温下放置0，5，10，15，20，24，48，72 h时按2.1项下色谱条件进样测定，以车叶草苷（14号峰）为参照。结果26 个共有峰相对保留时间的RSD为0.35%～1.09%（n=8），相对峰面积的RSD为0.69%～2.37%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置72 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（编号为A3），按2.2 项下方法制备供试品溶液，共6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，以车叶草苷（14号峰）为参照。结果26个共有峰相对保留时间的RSD为0.77%～1.96%（n=6），相对峰面积的RSD为 0.91%～1.93%（n= 6），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱研究

2.4.1 指纹图谱及对照指纹图谱生成与共有峰确定

按2.2 项下方法制备16 批样品的供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A 版分析。以A4 为参照图谱，获得16 批样品的HPLC 叠加指纹图谱。由图1 可知，共有峰有26个。通过与混合对照品溶液保留时间比对，共标定11 个色谱峰，分别为去乙酰车叶草酸酐（1 号峰）、阿魏酸（5号峰）、4-香豆酸（6号峰）、槲皮素（10号峰）、山柰素（12 号峰）、车叶草苷（14 号峰）、太子参环肽B（18 号峰）、五味子醇甲（20号峰）、五味子酯甲（22号峰）、五味子甲素（23 号峰）、五味子乙素（24 号峰）。详见图2。16 批样品的相似度分别为0.941，0.939，0.947，0.933，0.956，0.951，0.959，0.953，0.894，0.897，0.900，0.899，0.913，0.916，0.915，0.920，表明样品质量总体稳定。

2.4.2 参照峰选择及相对峰面积和相对保留时间计算

由图1 和图2 可知，车叶草苷（14 号峰）峰面积响应大且与前后峰分离好，故以车叶草苷为参照。16 批样品HPLC 叠加指纹图谱中各共有峰相对保留时间的RSD为0.19%～1.95%，相对峰面积的RSD为1.14%～2.87%。

图1 16批肝复康丸高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 16 batches of Ganfukang Pills

图2 混合对照品溶液高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.5 PLS-DA 模型建立与分析

2.5.1 PLS-DA 模型建立

为分析不同厂家样品的差异性，将26 个共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件，启动PLS - DA 程序，获得PLS - DA 模型［11］。提取 2 个主成分，行置换检验（设置分类矩阵变量，随机排列20 次），R2拟合直线和Q2拟合直线在Y坐标轴的截距分别为0.573 和- 0.255，提示所建模型不存在过拟合现象。详见图3。

图3 PLS-DA模型置换检验图Fig.3 Permutation test of PLS-DA

2.5.2 PLS-DA

PLS - DA 模型中所有数据点均在95%置信区间内，表明4 个生产厂家样品的整体质量差异不大；同一厂家样品紧密聚集，各批次间差距小，表明产品质量稳定（图4）。PLS-DA 载荷散点图中，距离中心离散程度越远，成分权重越大，对样品差异性作用也越大。太子参环肽B（18 号峰）、五味子醇甲（20 号峰）、车叶草苷（14号峰）、五味子甲素（23号峰）、五味子乙素（24号峰）5 种成分距离中心离散程度较远（图5）。10 个色谱峰的变量重要性投影大于1为差异标志物，其中太子参环肽B、五味子醇甲、车叶草苷、五味子甲素及五味子乙素5 个已知化合物对结果权重影响大于50%。详见图6。

图4 4个厂家肝复康丸的PLS-DA得分散点图Fig.4 PLS-DA scoring plot of Ganfukang Pills from four manufacturers

图5 16批肝复康丸的PLS-DA载荷散点图Fig.5 PLS-DA loading plot of 16 batches of Ganfukang Pills

图6 PLS-DA 变量重要性投影值图Fig.6 Variable importance in the projection plot of PLS - DA

3 讨论

3.1 指认指标选择

肝复康丸的君药五味子来源于木兰科植物五味子的干燥成熟果实，被《神农本草经》列为上品，其药理作用为保肝、抗氧化、调节中枢神经系统等。五味子含有木脂素、挥发油、有机酸、多糖等多种化合物，其中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在木脂素类成分中含量高［12-13］。太子参药食两用，具有健脾益气、润肺生津功效，为石竹科孩儿参干燥块根，广泛用于治疗肝炎、心绞痛及冠状动脉粥样硬化性心脏病等症，主要活性成分为太子参环肽类、氨基酸类、脂肪酸类、微量元素类等，且太子参环肽B 较其他环肽含量大［14-15］。民间最常用的抗肿瘤中草药为白花蛇舌草，以全草入药，味苦、甘，性寒，常用于治疗肝炎、咽喉痛、肝癌、胃癌等症［16-17］，目前从白花蛇舌草中分离出的化学成分主要有环烯醚萜类化合物（车叶草苷和去乙酰车叶草酸酐）、黄酮类化合物（槲皮素和山柰素）及有机酸类（阿魏酸和4-香豆酸）等。故本研究中选择五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、车叶草苷、去乙酰车叶草酸酐、槲皮素、太子参环肽B、山柰素、阿魏酸、4 - 香豆酸为指认指标，并考察方中指标性成分对不同厂家样品质量稳定性的影响［18］。

3.2 色谱条件选择

曾考察不同检测波长（190～400 nm），流动相不同溶剂（有机相为甲醇或乙腈，无机相为0.05%磷酸或0.05%醋酸）及同梯度比例，不同柱温（25，30，35 ℃），不同流速（0.8，0.9，1.0 mL/min），不同超声提取次数（1次、2次、3次），不同品牌色谱柱（Kromasil C18柱、Agilent Ecilipse C18柱）及不同品牌高效液相色谱仪（Agilent1260型高效液相色谱仪、UItimate 型高效液相色谱仪）对肝复康丸HPLC 分析结果的影响，综合分析色谱峰的数量、峰形分离效果，最终确定2.1 项下色谱条件作为肝复康丸HPLC叠加指纹图谱的分析条件。

3.3 方法评价

建立的HPLC 指纹图谱操作简单、准确、重复性好，与PLS- DA 技术结合，可为肝复康丸的质量标准提升提供参考。