耐盐深绿木霉TW320和拟康宁木霉TW1876生长和产孢条件优化

胡广艳,赵忠娟,b，杨合同，b*

(齐鲁工业大学(山东省科学院) a.生态研究所；b.山东省应用微生物重点实验室 山东 济南 250103)

盐胁迫作为最常见的非生物胁迫之一，能显著降低植物的产量并影响植物生理生化各方面的指标[1]。据统计，土壤盐渍化问题已经涉及了全球20%的耕地和33%的灌溉农田，严重影响农业生产，成为了世界范围内的一个重要农业问题[2-3]。我国黄河三角洲地区土壤盐渍化范围广，面积大，严重制约了该地区的土地利用和农业生产。目前研究发现，根际土壤中存在的有益微生物能够促进植物对非生物胁迫的耐受性，改善植物生长发育[4]。因此对植物进行微生物处理，寻找合适的植物-微生物组合，以此促进植物生长及植物抗胁迫能力，对作物生产具有重要意义[5]。

木霉菌是目前研究和应用最为广泛的生防真菌之一，是一类重要的植物根际促生真菌，可以促进植物生长、提高植物抗逆性、提高作物产量和品质。目前木霉菌已经开发为微生物菌剂，应用于农业生产实践[6]。目前国内外己经有50多种木霉商品化制剂[7],如美国的哈茨木霉T22菌株,俄罗斯的木霉制剂Myc01[8]等，在不同地区都取得了良好的作用效果。Huang等[9]将哈茨木霉(Trichodermaharzianum)SQR-T37制成生物菌肥，发现该生物菌肥对黄瓜立枯病的防效达到了81.82%；赵远征等[10]研究发现哈茨木霉可湿性粉剂对马铃薯黑痣病有防治效果和增产效果。但是，目前对于耐盐木霉菌株微生物制剂的研究和报道较少。

针对黄河三角洲盐渍化土壤中植物生长困难的问题，山东省科学院生态研究所分离多株具有较高耐盐活性的木霉菌株[11]，其中深绿木霉(T.atroviride)TW320和拟康宁木霉(T.koningiopsis)TW1876的耐盐性较高，拮抗病原菌和促生能力也较强，制备的木霉微生物菌剂在盐渍土壤作物种植过程中具有较高的应用前景。木霉菌剂目前的应用形式大多是孢子制剂，孢子的产生条件是木霉制剂生产的制约条件，例如深绿木霉可以用于生物防治，但产孢量较少，影响生产应用，池玉杰等[12]对其产孢条件加以研究，得到了深绿木霉最佳产孢条件；又如具有分解纤维素能力的绿色木霉产孢量不能满足工业需求，肖龙龙等[13]对其产孢条件加以优化，显著提高了其产孢量。前期研究发现耐盐木霉菌株TW320和TW1876培养过程中产孢较少，影响了制剂的制备及应用。本文对TW320和TW1876生长和产孢条件进行探究，寻找最优生长和产孢培养基，对木霉制剂工艺的研发具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 菌株

耐盐木霉菌株深绿木霉(T.atroviride)TW320和拟康宁木霉(T.koningiopsis)TW1876是山东省科学院生态研究所分别从山东东营黄河三角洲湿地和山东莱芜雪野湖湿地采集的土样中分离获得。

1.2 培养基

本研究选择9种不同培养基：马铃薯葡萄糖琼脂 (potato dextrose agar, PDA)培养基、马丁氏(Martin)培养基、察氏琼脂(Czapek dox agar, CDA)培养基、低营养琼脂(synthetic low nutrient agar, SNA) 培养基、玉米粉葡萄糖琼脂(cornmal dextrose agar，CMD)培养基、大豆玉米粉(soybean corn flour agar)培养基、无机磷琼脂 (inorganic phosphorus agar，MPA) 培养基、燕麦琼脂(oatmeal agar，OA)培养基、麦芽汁琼脂(malt extract agar，MEA)培养基，培养基成分如表1所示。

表1 各培养基成分

1.3 试验方法

1.3.1 pH对耐盐木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长和产孢的影响

以PDA培养基为基础培养基，用1 mol/L的盐酸和氢氧化钠将培养基pH调制成4、5、6、7、8、9、10、11，分别接种直径5 mm耐盐木霉菌株TW320和TW1876菌块于培养基边缘，在培养箱25 ℃恒温培养，第3天测量菌落直径，7 d后测量产孢量。每个处理重复5皿。

产孢量的计数采用血球计数板计数法[14]。取已培养好的菌株，用无菌量筒取无菌水20 mL，分两次转移到培养皿中，用5 mL的移液枪将孢子反复吹洗下来，混匀后转移至已灭菌的50 mL三角瓶中，充分振荡混匀后，用移液枪吸取少量孢子悬液滴加在血球计数板盖玻片的边缘，用五点法读取5个小格的孢子数。

木霉菌孢子个数(cfu/mL)=[(5小格孢子总数)/5]×25×104×稀释比例。

1.3.2 不同培养基对耐盐木霉菌株TW320与TW1876菌丝生长及产孢量的影响

将耐盐木霉菌株TW320和TW1876转接到PDA培养基，在25 ℃条件下恒温培养5 d后，用打孔器取直径5 mm的菌饼，接种到9种不同固体培养基(PDA、Martin、CDA、SNA、CMD、大豆玉米粉、MPA、OA、MEA)的边缘，置于25 ℃恒温培养箱中培养，第3天测量菌落直径，7 d后用血球计数法测量产孢量，产孢量计算同上。每个处理重复5皿。

1.3.3 不同碳源、氮源对耐盐木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长及产孢量的影响

采用察氏培养基作为基础培养基，设置7个不同的碳源处理，分别是麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、木糖、甘露醇和淀粉，每1 000 mL添加不同碳源各30 g，制成7种含不同碳源的固体培养基，以不加碳源的培养基作为对照；同时设置9个不同的氮源处理，分别是酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氢二铵、甘氨酸、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、尿素，每1 000 mL添加不同氮源各3 g，制成9种含不同氮源的固体培养基，以不加氮源的培养基作为对照。

耐盐木霉菌株TW320和TW1876在PDA培养基中25 ℃条件下恒温培养5 d后，用打孔器取直径5 mm的菌块放至上述各种不同培养基的边缘，放置于25 ℃恒温培养箱中培养，培养 3 d后测量菌落直径，7 d后用血球计数法测量产孢量，产孢量计算同上。每个处理重复5皿。

1.3.4 不同碳氮比对耐盐木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长及产孢量的影响

1.4 数据统计与分析

本研究每个处理设5个重复，利用SPSS(版本)软件对数据进行ANOVA方差分析，P<0.05表示存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同pH对耐盐木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长和产孢的影响

深绿木霉(T.atroviride)TW320在pH=4～11 内均可生长(图1(a))，pH= 4～8 内TW320菌丝较厚，可见绿色孢子产生，pH=9～11菌丝厚度减弱，孢子量减少。统计结果发现：当pH=4,5,6时，生长3 d的菌落直径无显著差异，生长速度最快；pH=9时，菌落直径最小；pH=5时，TW320菌株生长7 d的产孢量最多，为4.94×107cfu/mL；pH=9时，产孢量最少(表2)。综上，TW320培养最优pH为5。

图1 pH=4～11范围内木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长及产孢情况Fig.1 Mycelium growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 in the pH range 4 to 11

表2 不同pH对木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长及产孢量的影响

拟康宁木霉(T.koningiopsis)TW1876在pH=4～11 范围内菌丝生长浓密(图1(b))，绿色孢子明显。统计结果如表2所示，当pH=4、5、6时，菌落直径不存在显著差异，此时菌落直径最大，TW1876生长速度最快；当pH=9时，菌落直径最小；pH=11时，TW1876菌株生长7 d的产孢量最多，为1.76×108cfu/mL； pH=6时，产孢量最小，为0.47×108cfu/mL。综上，TW1876培养最优pH为11。

2.2 耐盐木霉菌株TW320和TW1876在不同培养基上的菌丝生长状况及产孢量

深绿木霉(T.atroviride)TW320在9种培养基上均可生长，但在不同培养基上菌丝量、孢子数量和孢子颜色有明显不同(图2(a))。统计结果显示：PDA培养基上生长3 d的TW320菌落直径与其他处理相比存在显著差异，生长速度最快，在大豆玉米粉培养基上的生长速度次之，在CDA培养基上菌落直径最小；TW320在大豆玉米粉培养基上产孢量最多，为3.13×107cfu/mL，在SNA培养基上的产孢量最少，为0.05×107cfu/mL(表3)。因此，TW320培养的最优培养基为大豆玉米粉培养基。

图2 木霉菌株TW320和TW1876在9种不同培养基上的菌丝生长和产孢状况Fig.2 Mycelium growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on nine different media

由图2b可见，拟康宁木霉(T.koningiopsis)TW1876在9种培养基上均可生长,菌丝生长量、产孢量和孢子颜色在不同培养基上表现出明显差异。在PDA培养基上，TW1876生长最好，菌丝浓密，绿色孢子明显，其菌落直径与其他处理存在显著差异，生长速度最快,在CDA培养基上菌落直径最小；TW1876在PDA培养基上的产孢量也最多，为9.68×107cfu/mL，在大豆玉米粉培养基上的产孢量最少，为0.07×107cfu/mL(表3)。综上，选取PDA培养基为TW1876培养的最优培养基。

表3 不同培养基对木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长及产孢量的影响

2.3 耐盐木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳源、不同氮源的培养基上的菌丝生长状况及产孢量

深绿木霉(T.atroviride)TW320可以利用多种碳源生长和产孢(图3(a))。统计结果显示：以麦芽糖作为碳源时，培养3 d的TW320的菌落直径最大，生长速度最快，其次是淀粉、木糖、乳糖、葡萄糖和蔗糖，无碳源的培养基的菌落直径最小；以木糖作为碳源时产孢量最多，为2.93×106cfu/mL，以淀粉作为碳源时的产孢量最少(表4)。综上，麦芽糖最有利于TW320菌丝生长，木糖次之，但木糖最有利于其产孢，因此选取木糖作为深绿木霉TW320生长的最佳碳源(表4)。

图3 木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳源的培养基上的菌丝生长及产孢状况Fig.3 Mycelial growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on medium containing different carbon sources

拟康宁木霉(T.koningiopsis)TW1876对不同碳源的利用差别显著(图3(b))。结果表明：以淀粉和麦芽糖作为碳源时，生长3 d的菌落直径无显著差异，生长速度最快，其次是葡萄糖、乳糖和木糖，无碳源时的菌落直径最小；乳糖作为碳源时，产孢量最多，为6.75×106cfu/mL，无碳源时的产孢量最少。综上，选取乳糖作为拟康宁木霉TW1876培养基的最佳碳源(表4)。

表4 不同碳源对木霉菌株TW320和 TW1876菌丝生长及产孢量的影响

深绿木霉(T.atroviride)TW320在含不同氮源的培养基上生长和产孢存在明显差异(图4(a))。统计结果显示：以酵母膏为氮源时，TW320菌株菌丝较浓密，其菌落直径和产孢量与其他处理比均存在显著差异，生长速度最快，产孢量最多，为5.85×106cfu/mL；在无氮源培养基中TW320生长较慢，产孢量最少，为0.08×106cfu/mL(图4(a)，表5)。因此，选取酵母膏作为培养深绿木霉TW320的最佳氮源。

图4 木霉菌株TW320和TW1876在含不同氮源的培养基上的菌丝生长及产孢状况Fig.4 Mycelial growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on medium containing different nitrogen sources

由图4(b)可知，拟康宁木霉(T.koningiopsis)TW1876对不同氮源的利用也不同。以酵母膏作为氮源时，其菌落直径与其他氮源处理相比存在显著差异，此时TW1876生长速度最快，以蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸和牛肉膏为氮源时，菌落生长速度次之，以尿素作为氮源时的菌落生长速度最慢；以甘氨酸为氮源时产孢量最多，为3.83×106cfu/mL，无氮源时的产孢量最少，为0.3×106cfu/mL(表5)。综上，以甘氨酸为氮源时，TW1876生长速度较快，产孢量最多，故以甘氨酸作为培养TW1876的最佳氮源(表5)。

表5 不同氮源对TW320和TW1876菌丝生长及产孢量的影响

2.4 耐盐木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳氮比的培养基上的菌丝生长状况及产孢量

图5 木霉菌株TW320和TW1876在含不同碳氮比的培养基上的菌丝生长及产孢状况Fig.5 Mycelial growth and sporulation of Trichoderma strains TW320 and TW1876 on medium with different C/N ratios

表6 不同碳氮比对木霉菌株TW320和TW1876菌丝生长及产孢量的影响

3 讨论

目前我国土壤盐渍化面积连年增加，严重影响了植物的生长，降低了粮食的产量。植物-微生物联合修复方法的出现可以有效缓解这种状况。Siemering 等[15]在研究报告中指出，植物根系环境是真菌的主要栖息地。木霉作为一种植物促生真菌，可以定殖在植物根部，不仅可以促进植物生长，还可以提高植物的抗逆能力，从而减少化肥、农药的使用，避免给环境造成污染，促进农业的可持续发展。耐盐木霉的使用可以提高植物对盐渍环境的适应能力,是减轻土壤盐渍化危害以及开发利用沿海滩涂等盐渍化土地资源的重要途径之一。但是，耐盐木霉的产孢量不足，限制了大规模生产孢子制剂。

耐盐木霉固体产孢培养基优化实验，为大量获取孢子提供了可能，为木霉制剂的发展做好了准备工作，对未来农业的发展具有重要的社会和生态学意义。