GRP78及其家族的应激表达对高原缺氧条件下机体损伤机制的探讨

任振堃，聂进

(锦州医科大学附属第三医院，辽宁 锦州 121000)

高原地区具有的特殊低压低氧的自然环境会对进入该地区的非藏族人群造成各种损伤，如出现头晕、恶心、失眠健忘、不由自主哭泣等症状，严重者会出现高原性脑水肿、肺水肿等致命性的疾病[1]。低压低氧的高紫外线辐射会导致身体各组织中出现活性氧大量蓄积的现象，使其损伤DNA、核酸、蛋白质等各种生物大分子，从而诱发组织损伤。有研究表明热休克蛋白70(HSP70)具有重要的细胞作用，其在高原地区低压低氧条件刺激下，应激生成的HSP70可以提高机体对再次同类型刺激的耐受程度，从而使细胞能够维持基本的生理代谢，增强细胞的有效生存率[2-5]。

实验表明：HSP70是应激反应条件下机体活细胞对刺激产生的应答物质，能促使机体及细胞对低压低氧环境应激的适应；低压低氧环境应激使HSP70的诱导应激表达强烈；王晓林等[6]人发现热休克反应是哺乳动物对高海拔(缺氧)的一种适应形式。低海拔哺乳动物进入不同高海拔地区均出现不同程度的高原反应，海拔与缺氧成正性相关，进入高海拔地区机体细胞层面内的HSP70诱导应激表达越强，但海拔应激存在阈值，超过阈值后其保护作用会极大减弱或消失。而HSP70的应激改变取决于转录及翻译水平[7]。实验证明HSP70敏感性较强单独为一过性表达，而GRP78也是被人类较早发现的内质网伴侣蛋白之一，是与肿瘤及创伤应激等相关的内质网应激表达中含量比较高的一种葡萄糖调节蛋白。从传统模式生物(线虫、非洲爪蟾等)到哺乳动物(小鼠、兔子、狗、猕猴)乃至人类，都存在与GRP78同源的一些基因。现在主流研究多是关注葡萄糖调节蛋白(GRPs)在饥饿、缺氧、氧化应激与炎症、缺血再灌注等情况下，引起未折叠与错误折叠蛋白在内质网腔系统之中积累，同时又造成钙离子平衡的混乱，从而引起内质网启动应激，进而诱导了GRPs基因的应激表达，形成保护效应[9-15]。GRP78作为在肿瘤缺氧和创伤应激时，率先启动的内质网应激蛋白和驻留蛋白[8-15]是热休克蛋白70家庭成员之一。HSP70与GRP78之间的存在着60%以上的氨基酸的序列同源性，不同种属哺乳动物之间GRP78氨基酸序列高度同源，像爪蟾的GRP78序列和大鼠为90.7%，与人类的同源性为89.9%．故本实验采用直接一步进藏法和预留低海拔时原始血样研究GRP78及HIF-1α、HSP70等的表达对初次入藏人群的保护作用，通过考察相关的生化指标和蛋白表达的变化，一起阐明其保护作用机制。

1 材 料

1.1 试剂

人葡萄糖调节蛋白-78(GRP78)ELISA酶联免疫检测试剂盒(批号E20201210)购自江莱生物科技有限公司、HIF-1α ELISA酶联免疫检测试剂盒(批号E20201210)购自江莱生物科技有限公司、人热休克蛋白70(HSP70)ELISA酶联免疫检测试剂盒(批号E20201210)购自江莱生物科技有限公司。

1.2 仪器

MuLISKANMK3多功能酶标仪(Thermo公司)；LRH生化培养箱(上海-恒科科学仪器有限公司)；冷冻高速离心机(Thermo公司)。

1.3 一步法进藏缺氧耐受实验

由6名健康成年男女组成的旅行团(49.67±12.45)岁，按照年龄性别分成3组男女各半，分为30～35岁组、50～55岁组、60～62岁组。分别于从低海拔出发当天，到达西藏拉萨24、72、168 h后为限，分别进行采集血清和血浆各2管/(人·次)，并存放于-30 ℃的冰箱内待用。

1.4 蛋白表达水平的检测

将在藏期间取样-30 ℃的人体血清血浆标本：(1)使用试剂盒自带缓冲液把抗体液稀释至1～10 μg/mL。在96孔板的反应孔中加0.1 mL稀释后的抗体，然后4 ℃过夜。次日弃去反应孔内的溶液，使用洗涤缓冲液洗洗涤3次；(2)加样：加一定量的稀释后的待检样品0.05 mL于上述已被包被之反应孔之中，置于37 ℃恒温孵育箱内孵育1 h。然后洗涤(同时做好空白孔，阴性对照孔与阳性对照孔)；(3)加酶标抗体：于各个反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(且过经滴定后的稀释度)0.05 mL。置于37 ℃恒温孵育箱内孵育0.5～1 h，然后进行洗涤；(4)加底物液显色：在各个反应孔之内加入当天配制好的0.1 mL TMB底物溶液，37 ℃孵箱内孵育10～30 min；(5)终止反应：于各反应孔中加入2 M硫酸0.05 mL；(6)结果判定：可用于白色背景，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450 nm(若以ABTS显色，则410 nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 通过ELISA酶联免疫检测法测定进藏后不同时间的GRP78/HSP70/HIF-1α的热休克反应

因实验人群规模较小，可能对于结果造成偏移，以现有实验数据统计分析可知：在男性人群进藏后第3日表达最强，男性与女性组间在第3日的OD值无统计学意义，第3日后表达开始下降，在第10日左右表达低于女性；在女性人群进藏后平均第7日表达最强，同时表达强度也低于男性；因年轻人群活动量较大，所以表达强度较中年、老年人群强烈，同时在第10日左右，因为机体适应能力较强会造成表达强度开始大幅度低于中老年组，见表1、图1。

表1 进藏后不同组各时间点的GRP78的热休克反应的OD值

通过球形验证证明，总体人群和男性人群的基于组别：测量时间的GRP78的表达差异(P>0.05)不具有统计学意义。而女性的基于组别：测量时间的GRP78的表达差异P<0.05具有统计学意义，意味着GRP78的表达可能存在性别差异。

低海拔地区的男性女性在直接进入高海拔的后据出现HSP70的强烈表达，年纪大的组别表达强度大于低年龄组。同时女性组表达强度高于男性组，且表达持续时间较长，男性中高年龄组基本上在10 d左右就恢复到内地表达水平。而女性组较长期维持高于内地的表达水平，见表2。

图1 进藏后不同组别时间的GRP78的热休克反应的OD值柱状图

表2 进藏后不同组各时间点的HSP70的热休克反应的OD值

经过球形检验证明组间对比，各时间点上存在显著差异，组别：测量时间P<0.05。现有结果显示女性的HIF-1α的应激表达较男性较晚，且最大表达强度略低。但是女性高表达时间较长，可以较长期(如1 w左右)维持。男性应激表达启动较快，但下降较快不能长期维持，见表3。

表3 进藏后不同组各时间点的HIF-1α的OD值

经过球形检验证明HIF-1α的表达在组别：测量时间方面P=0.993(P>0.05)不具备统计学意义，且经过以性别分别建组验证均未发现组别：测量时间方面存在具备统计学意义。

2.2 现有实验组在高原上高原应激反应情况

因实验条件所限造成样本总量较小，实验代表性与可靠性可能存在不足，通过现有实验发现女性的缺氧耐受情况可能优于男性，但存在女性在高原地区缺氧低压环境下睡眠质量较低的现象，高年龄组有出现需要内地1倍以上的剂量的安眠药保证睡眠的情况。同时，30～35岁组与50～55岁组因为活动量较大造成吸氧批次较高，但高年龄组因为总体活动量受限吸氧较少，见表4。

表4 进藏后不组别高原反应情况(0～10 d)

3 讨 论

本文利用ELISA酶联免疫检测法等手段对高高原地区低压低氧条件下诱导的热休克反应产物进行研究，并且利用相关实验重现了验证了处于高高原条件下时，因为急性相关高原反应产生呼吸困难等临床现象。同时因实验条件所限样本量较小，且使用的ELISA酶联免疫检测试剂盒检测精度、样本保存运输环境都可能造成样本偏移，现有实验结果表明：其可能是促使生物机体在细胞层面应对低氧低压环境的条件反应产生的保护性应激反应，使机体及细胞在低压低氧情况能够有效活动及生存；低氧低压环境的应激条件下诱导得GRP78的表达效果强烈，是被公认的内质网应激最敏感标志性蛋白之一。哺乳动物在长期生存得相对低海拔地区快速由飞机等载体到达高海拔低压低氧环境后，均会被诱导出现不同程度上不同种类的热休克反应。ELISA酶联免疫检测测定发现不同性别/不同年龄的人群在高海拔地区的表达量不同。以GRP78表达为例：其的表达存在性别差异性，在男性人群进藏后第3日表达最强，第3日后表达开始下降，在第10日左右表达低于女性；在女性人群进藏后平均第7日表达最强，同时表达强度也低于男性，且通过球形验证证明，总体人群和男性人群的基于组别：测量时间的GRP78的表达差异不具有统计学意义。而女性的基于组别：测量时间的GRP78的表达差异具有统计学意义。同时，意味着GRP78的表达可能存在性别差异。年轻人群表达强度较中年、老年人群强烈，第10日左右，因为机体适应能力较强会造成表达强度开始大幅度低于中老年组而差异显著。实验结果显示：高原缺氧环境可以使人群的外周血液中GRP78的表达显著升高，而在平原低海拔地区人群如果无炎症、肿瘤等外源性因素，其外周血液中GRP78表达水平较低。通过ELISA酶联免疫检测测定，原生低海拔人群直接进入高原地区，在低压低氧条件下，原生低海拔人群的GRP78热休克蛋白会由于缺氧应激而出现高表达，且男女差异较大维持时间及反应表达峰值均出现性别差异。说明机体为了维持缺氧环境下的有效生存会在一定程度上通过GRP78的快速而有效表达于维持机体在细胞水平上的正常生理功能。