茶多酚对普鲁兰- 明胶膜理化及抗氧化、抗菌性能的影响

王倩婷， 钟昔阳,2,*， 马汝悦， 张 恒， 罗水忠,2，赵妍嫣,2， 郑 志,2

(1.合肥工业大学 食品与生物工程学院， 安徽 合肥 230601；2.安徽省农产品精深加工重点实验室， 安徽 合肥 230601)

食品包装技术是一种为维持食品或农产品在运输、销售、贮藏过程中的品质，延长产品保质期的加工技术，在食品研究领域备受关注。塑料包装是日常最为常见的一种食品包装方式[1]，但由于塑料自身的不可再生和不可生物降解性对生态环境造成了严重的影响[2]；因此，发展新型包装材料成为当前研究的迫切需求。近年来，生物可降解天然高分子材料(蛋白质[3]和多糖[4]等)被引入包装研究领域，并成为国内外学者的研究热点。为提高包装材料的抗菌和抗氧化特性，在其中添加一些具有良好抗氧化和抗菌性能的天然活性物质[5]制备生物活性膜成为新的研究方向，这种膜主要通过抑制食品表面的微生物繁殖和氧化反应，从而有效延长食品的保质期[6]。

普鲁兰多糖是一种由短梗霉(Aureobasidiumpullulans)产生的线性胞外多糖，由α-(1→4)和α-(1→6)糖苷键连接的麦芽糖单元组成[7]，它无毒无味，具有好的阻隔性和柔性，可作为食品的保护性包装[8]。明胶由胶原蛋白部分水解得到，具有生物降解性好、生物相容性好、成膜能力强、阻隔性能好、成本低、无毒等优点[9]，是食品中应用最广泛的蛋白质之一[10]。茶多酚(tea polyphenols, TP)是一种安全、天然的茶叶生物活性物质，其优异的抗氧化和抗菌性能被认为是改善可降解食品包装膜性能的良好添加剂[11-14]。虽然普鲁兰多糖和明胶在膜的制作方面得到了广泛应用，但有研究发现，普鲁兰多糖的亲水性较强，在较高的相对湿度下，普鲁兰膜的断裂伸长率显著降低[8]；明胶吸湿性高和断裂伸长率低[15]。而将普鲁兰多糖与明胶混合制备复合膜，有望解决各自的缺点；另外，在普鲁兰- 明胶复合膜中添加TP以制备一类新型生物活性膜也鲜有报道。

本研究将TP添加到普鲁兰- 明胶复合膜中，研究了TP的质量分数对复合膜的微观结构(分子间相互作用和表观形貌)、理化性质(热性能、阻隔性能、机械性能等)、功能特性(抗氧化活性和抗菌活性)以及TP缓释性能的影响，以期得到一种性能优良的抗菌、抗氧化复合膜，为食品包装领域相关研究提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

明胶、茶多酚(纯度98%)，上海源叶生物科技有限公司；普鲁兰多糖，上海阿拉丁试剂有限公司；甘油(丙三醇)，上海国药集团化学试剂有限公司；DPPH(纯度96%)，上海麦克林生化科技有限公司；大肠杆菌ATCC25922(E.coli)、金黄色葡萄球菌ATCC29213(S.aureus)，合肥工业大学食品微生物实验室。其他所用试剂和化学品均为分析纯。如无特别说明，所有溶剂均为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

HH- 4型四孔数显恒温磁力搅拌水浴锅，东莞市新锐仪器有限公司；84- 1A型磁力搅拌器，金坛市城东新瑞仪器厂；LHS- 150HC- Ⅱ型恒温恒湿箱、DHG- 9240型电热鼓风干燥箱、DNP- 9272型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司；Gemini500型热场发射扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司公司；TGA8000型热重分析仪，美国PE公司；电子数显千分尺，上海台海工量具有限公司；CR- 400型全自动色度计，苏州市宇宏光电科技有限公司；UV- 4802型紫外- 可见分光光度计，上海Uniko仪器有限公司；TA.XT.plus型物性测试仪，英国Stable Micro Systems公司；HQ45Z型恒温摇床，武汉中科科仪技术发展有限责任公司；SW- CJ- 1G型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1茶多酚-普鲁兰-明胶复合膜的制备

1)普鲁兰- 明胶基础膜液的制备。称取一定质量的明胶粉末和普鲁兰多糖粉末分别置于90 ℃和50 ℃蒸馏水中，磁力搅拌确保其完全溶解，得到质量分数均为6%的明胶和普鲁兰多糖溶液；将明胶溶液和普鲁兰多糖溶液以1∶1的体积比混合，在50 ℃下磁力搅拌20 min得到均匀的混合液；向混合液中加入质量分数20%的甘油(基于明胶和普鲁兰多糖的总干质量)，在50 ℃下搅拌30 min，得到普鲁兰- 明胶基础膜液。

2)茶多酚的添加。用蒸馏水配制不同质量分数的茶多酚溶液(0%、2%、4%、6%、8%、10%，基于明胶和普鲁兰多糖的总干质量)，均以1∶1的体积比与基础膜液混合，室温下搅拌1 h，得到茶多酚- 普鲁兰- 明胶复合膜液。

3)干燥成膜。将20 mL茶多酚- 普鲁兰- 明胶复合膜液均匀流延在聚四氟乙烯模具(10 cm×10 cm×0.2 cm)上，室温(25±2)℃干燥大约20 h后成膜，将膜脱离模具后放在密封袋中保存备用。所有样品在测试前均放置在恒温恒湿培养箱(25 ℃，相对湿度53%)中平衡至少48 h。最后，根据茶多酚的质量分数将复合膜分别命名为：TP- 0%、TP- 2%、TP- 4%、TP- 6%、TP- 8%和TP- 10%。

1.3.2复合膜微观结构测定

1.3.2.1 红外光谱测定

将膜裁剪成1 cm×1 cm大小，利用傅里叶红外光谱仪测量薄膜的红外光谱特性。测试条件：衰减全反射(ATR)模式，在650～4 000 cm-1进行64次扫描，分辨率为4 cm-1。

1.3.2.2 扫描电镜观察

在真空条件下对1 cm×1 cm的薄膜喷金处理后，用热场发射扫描电子显微镜(SEM)观察薄膜的表观形貌，加速电压为50 kV，放大倍数为500倍。

1.3.3复合膜理化性质测定

1.3.3.1 热重分析方法

采用热重分析仪对薄膜的热性能进行了评价。称取质量约为5 mg的样品，在动态氮气环境下以10 ℃/min的升温速率从30 ℃加热到800 ℃。

1.3.3.2 复合膜水蒸气渗透性的测定

复合膜水蒸气渗透性[WVP,g·m/(m2·s·Pa)]的测定参照Shao等[16]的方法，稍作修改。将薄膜样品(10 cm×10 cm)覆盖在装满硅胶的烧杯(50 mL)上并用橡皮筋固定，再放置在温度为25 ℃、相对湿度为75%的恒温恒湿培养箱中，每24 h称量烧杯质量，WVP计算见式(1)。

(1)

式(1)中，m为烧杯在t(s)时间段的质量变化，g；d为膜厚，m；A为曝光膜面积，m2；ΔP为实验条件下薄膜两侧水蒸气的分压差，2.38×105Pa。

1.3.3.3 复合膜颜色的测定

使用全自动色度计测量薄膜的颜色，其中L*代表亮度，a*代表红绿度，b*代表黄蓝度。用标准白板对全自动色度计进行校准(L=81.84,a=-0.65,b=5.55)。总色差ΔE的计算见式(2)[16]。

(2)

1.3.3.4 复合膜透光性的测定

坑道工程口部伪装是工程防护重要研究方向之一，一些工程在施工过程中破坏了原有地貌，伪装时需要轻质仿石器材来模拟口部附近的真山石，造成口部是一些普通石块的假象，从而形成有效欺骗。随着园林行业的发展、仿石技术的进步，在可见光波段模拟山石已非难事。然而军事侦察主要波段除了可见光外还有近红外、热红外、雷达等波段[1-3]，而真山石的光学、热红外和雷达波段特征具有独特性，园林仿石很容易被揭露。所以，能起到伪装作用的仿石器材需要一些新技术、新材料才能达到对抗多频谱侦察的需要。

使用紫外- 可见分光光度计测定薄膜对紫外光和可见光的阻挡性能。将薄膜裁剪成1 cm×4 cm的条状，放置在石英比色皿透明的一侧，在200～800 nm进行全波长扫描得到薄膜的透射率，空白石英比色皿作为对照。

1.3.3.5 复合膜机械性能的测定

参照Wu等[12]的方法，用物性测试仪测定薄膜的机械性能[拉伸强度(TS, MPa)和断裂伸长率(EAB, %)]。将薄膜裁剪成1 cm×10 cm的长条，薄膜两端用夹板固定，以10 mm/s的拉伸速度拉伸至薄膜完全断裂。TS和EAB的计算见式(3)、式(4)。

(3)

式(3)中，F为薄膜断裂时的最大力，N；S为初始薄膜的横截面积(厚度×宽度)，mm2。

(4)

式(4)中，L0为上下夹板之间的初始距离，mm；L1为薄膜断裂后上下夹板之间的距离，mm。

1.3.4复合膜功能特性测定

1.3.4.1 复合膜抗氧化性能的测定

为了评价薄膜的抗氧化活性，参考Dou等[17]的方法，进行DPPH自由基清除能力测试。准确称取薄膜30 mg置于45 mL蒸馏水中搅拌至完全溶解后，取1 mL膜液分别与5 mL DPPH乙醇溶液(0.075 mmol/L)和乙醇溶液混合，在黑暗中孵育30 min，在517 nm处测量吸光度，分别记为Ag和Ac；用1 mL蒸馏水替换膜液，操作同上，分别记为A0和空白对照。膜的DPPH自由基清除率(%)计算见式(5)。

(5)

运用菌落计数法[18]评价薄膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种在固体溶菌肉汤(LB)培养基上，置于37 ℃的恒温培养箱中培养24 h；再从培养基上挑取单菌落接种到5 mL的液体LB培养基中，置于37 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养24 h。准确称取薄膜(100±2)mg放入装有20 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)的锥形瓶中，在37 ℃的恒温培养箱中放置24 h；接着，加入200 μL菌悬液(用PBS稀释至1×105～5×105CFU/mL)，不加膜的锥形瓶作为对照组；最后，将所有锥形瓶置于37 ℃的恒温培养箱中培养12 h后，取100 μL样液涂布平板，并在37 ℃下培养48 h，观察菌落数量。细菌生长抑制率计算见式(6)[19]。

(6)

式(6)中，Ns和Nc分别表示检测样品平板上的菌落数量和对照组平板上的菌落数量。

1.3.5茶多酚的缓释性能测定

TP的缓释实验在Gao等[13]方法的基础上稍作修改。将20 mL膜液干燥后形成的膜放入50 mL蒸馏水中，置于25 ℃的恒温培养箱中，分别在3、6、9、12、24、48、72、96 h吸取1 mL样液，每次取完后用1 mL蒸馏水补充样液至原体积，取样前后应对样液进行振荡处理确保样液的均匀性。采用Folin- Ciocalteu法测定样液中TP的质量，TP释放率计算见式(7)。

(7)

式(7)中，m1为样液中TP质量，mg；m0为膜中TP质量，mg。

1.4 数据处理

所有膜样品至少分别准备3份，每个实验至少重复3次。采用IBM SPSS Statistics 26分析软件对数据进行单因素方差分析和5%显著性水平的Duncan 多重检验(P<0.05)，结果用平均值±标准偏差表示；使用 Origin 2021软件分析数据并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 复合膜微观结构分析

2.1.1复合膜分子间相互作用分析

a, TP- 0%; b, TP- 2%; c, TP- 4%; d, TP- 6%; e, TP- 8%; f, TP- 10%。

2.1.2复合膜表观结构分析

图2显示了SEM观察得到的普鲁兰- 明胶复合膜添加不同质量分数TP后的微观结构。由图2(a)可以看出，未添加TP的普鲁兰- 明胶复合膜表面相对光滑均匀(忽略膜自身由于干燥形成的褶皱)，说明普鲁兰多糖和明胶的相容性很好。加入TP后，复合膜的微观结构发生了变化。随着TP质量分数的增加[图2(b)～(d)]，复合膜表面变得粗糙，在膜表面没有发现颗粒物，说明TP均匀地分散在膜基质中使膜形成了更加致密的网络结构。然而，当TP质量分数增加到8%和10%时[图2(e)、(f)]，发现膜表面出现裂纹以及大的颗粒物，这可能是过量的TP在成膜基质中大量聚集和不均匀分散所致。Lei等[11]将TP添加到果胶- 魔芋葡甘聚糖复合食用膜中，发现TP对膜的微观结构产生了类似的影响。

图2 添加不同质量分数茶多酚的普鲁兰- 明胶复合膜的扫描电镜分析

2.2 复合膜理化性质分析

2.2.1复合膜热稳定性分析

热重分析(TGA)是研究复合膜热稳定性的一个重要方法，所有复合膜在30～800 ℃的热降解曲线见图3。由图3(a)可以看出，所有复合膜主要有2个阶段的热降解。第一阶段发生在30～160 ℃，这主要与聚合物结构中吸附水和结合水的蒸发有关[25]，在这一阶段各复合膜之间的失重率无明显差距，约为8%；第二阶段发生在170～400 ℃，这一阶段膜基质中的大分子聚合物，如明胶[26]和普鲁兰多糖[27]发生广泛热降解，对照组的失重率最大，约为57.48%，随着TP质量分数的增加，复合膜的失重率降低，最低约为52.75%。由图3(b)可以看出，本研究添加的不同质量分数的TP并没有对普鲁兰- 明胶复合膜的热稳定性产生显著性影响。

图3 添加不同质量分数茶多酚的普鲁兰- 明胶 复合膜的热稳定性分析

2.2.2复合膜水蒸气渗透性分析

水蒸气渗透性是评估薄膜阻隔性能的一个很重要的参数，与食品和环境之间的水分迁移有关，对薄膜来讲WVP值越低越有利[28]。添加不同质量分数TP的普鲁兰- 明胶复合膜的WVP值的变化趋势见图4。与对照组相比，添加TP的普鲁兰- 明胶复合膜的WVP值随TP质量分数的增加呈现先减少后增加的变化趋势，TP- 6%的复合膜WVP值最小，约为1.55×10-13g·m/(m2·s·Pa)，TP- 10%的复合膜WVP值最大，甚至超过对照组(2.63×10-13g·m/(m2·s·Pa)，达到了3.11×10-13g·m/(m2·s·Pa)。WVP值的这种变化是因为适当质量分数的TP和膜基质(普鲁兰多糖和明胶)通过分子间相互作用形成了氢键，从而形成更致密的膜结构，而这种膜结构使得大分子聚合物的自由体积减小，水分子通过薄膜的路径的弯曲度增加，因此WVP值显著降低(P<0.05)[28]；然而，当TP质量分数过高时，一方面，薄膜表面出现裂痕有利于水分子的快速渗透，另一方面，部分TP裸露在薄膜表面并发生聚集，导致游离O—H基团增加，增加了薄膜与水分子的相互作用，因此WVP值显著增大(P<0.05)。FTIR和SEM的结果也证实了这一点。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.2.3复合膜颜色分析

添加TP后普鲁兰- 明胶复合膜颜色变化见表1。由表1可知，TP的质量分数与复合膜L值成反比，与a、b值成正比，即随着TP质量分数的增加，复合膜的亮度显著降低(P<0.05)，同时呈现越来越红，越来越黄的变化趋势，这是因为TP本身呈黄褐色，它是影响薄膜颜色变化的主要因素，这与卢俊宇等[29]的研究结果一致。而总色差ΔE与L、a、b值有关，随着L、a、b值的变化，ΔE也发生变化，且ΔE随着TP质量分数的增加呈现减小的趋势。

表1 添加不同质量分数茶多酚对普鲁兰- 明胶复合膜颜色的影响

2.2.4复合膜透光性分析

复合膜在200～800 nm的紫外- 可见光透过率见图5。观察图5发现，在200～280 nm的紫外区，所有薄膜均表现出良好的阻挡能力，其中对照组的透过率最高，但在280 nm时也仅有14.41%，对照组表现出良好的阻隔性能是因为成膜基质大分子聚合物明胶中含有的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和二硫键在这一范围内有吸收[17]。TP的加入几乎阻挡了所有紫外光的透过，这是因为TP中含有大量苯环[30]。在350～800 nm的可见光区，所有膜的透过率都随着波长的增加而增大，并在800 nm处达到最大值，对照组膜的透过率在同一波长处始终比实验组的大，这是由于膜的颜色和TP质量分数的影响。

a, TP- 0%; b, TP- 2%; c, TP- 4%; d, TP- 6%; e, TP- 8%; f, TP- 10%。

2.2.5复合膜机械性能分析

薄膜的强度和柔韧性通常用机械性能(拉伸强度和断裂伸长率)来表征。添加不同质量分数TP的普鲁兰- 明胶复合膜的机械性能见图6。由图6可知，当没有添加TP时，复合膜的TS和EAB分别为10.41 MPa和71.23%，随着TP质量分数的增加，TS先增大后降低，在复合膜TP- 6%时达到最大值(18.13 MPa)。TS的升高是因为TP与明胶和普鲁兰多糖之间由于分子间相互作用使膜形成了更致密的网络结构；但是当TP质量分数过高时，TP在膜中不均匀分散且发生聚集，因此TS降低，这与FTIR和SEM的结果一致。EAB呈现出相同的变化趋势，这与Liu等[31]的研究结果一致。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.3 复合膜功能特性分析

2.3.1复合膜抗氧化性能分析

薄膜的抗氧化活性经常用其对DPPH自由基的清除能力来评估。图7显示了添加不同质量分数TP的普鲁兰- 明胶复合膜的DPPH自由基清除能力的变化。由图7可以看出，对照组也具有微弱的抗氧化性(6.07%)，这是由于明胶中含有COOH和NH2基团[32]。随着TP质量分数的增加，薄膜的DPPH自由基清除率也显著增加(P<0.05)，TP- 10%复合膜达到了最大值87.44%。TP的抗氧化机理是终止自由基链式反应，利用具有强供氢能力的酚羟基清除活性氧，因此，复合膜的DPPH自由基清除率与其总酚含量成正比[33]。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.3.2复合膜抗菌性能分析

利用菌落计数法评估了复合膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果，结果见图8。由图8可以看出，对照组对2种细菌均无抑制作用，TP的质量分数与抑菌率呈正相关关系，随着TP质量分数的增加，薄膜的抑菌效果也呈现显著增强(P<0.05)的趋势，TP- 10%复合膜对2种菌抑菌率均达到最大值，其中对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率分别为85.22%和95.73%。有研究认为TP的抗菌机理可能是因为TP中含有的酚羟基与细胞蛋白(氨基或羧基)相互作用从而抑制了细菌的生长[16]。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.4 茶多酚的缓释性能分析

图9是复合膜中的TP释放率随时间的变化。由图9可以看出， 所有复合膜中TP的释放曲线趋于一致，其释放率随时间的增加而增加， 最后趋于不变。在24 h后，释放率最高达到63.79%；释放48 h 后，最高达到70.11%；释放96 h后，最高达到70.23%。释放早期，释放率曲线增幅迅速、显著，这表明大量的TP从膜中释放到蒸馏水中，其原因可能在于释放早期复合膜中游离的TP较多，率先释放。随着时间的延长，释放率曲线整体是缓慢增长且趋于平缓，其增长的原因在于TP释放到蒸馏水中量的累计效应，但增幅变缓，表明后期释放TP的速度比前期小，TP越来越不易从膜中释放到水中。一方面，这是因为明胶独特的控释特性(明胶的溶胀性能是其控释的主要原因，控释机制是通过阻止水向载体的渗透，在剂型周围形成黏滞水凝胶屏障层来捕获活性物质)[34]；另一方面，这可能是由于TP与膜基质间的分子相互作用。这说明将TP添加到普鲁兰- 明胶复合膜中对TP有一定的缓释效果，Gao等[13]研究TP在果胶- 壳聚糖膜中的释放性能时发现类似的结果。

图9 普鲁兰- 明胶复合膜TP缓释性能的变化

3 结 论

本研究将不同质量分数的TP(0%、2%、4%、6%、8%和10%)添加到普鲁兰- 明胶复合膜中，制备了一种抗氧化、抗菌生物活性膜。研究结果表明：TP的质量分数会影响复合膜的微观结构、理化性质、功能特性以及TP的缓释性能。TP通过与膜基质的分子间相互作用均匀地分散在膜中，使膜具有致密的网络结构。当TP质量分数为6%时，复合膜的拉伸强度和断裂伸长率较佳，水蒸气渗透性最低，且具有很好的阻光性能。TP的添加赋予了膜良好的抗氧化和抗菌性能，同时也较好地实现了TP的缓释。研究旨在为TP- 普鲁兰- 明胶复合膜在食品包装领域的应用提供一定的理论基础。