市售调制乳中香精关注成分的分析及风险评估

石丽丽， 李 婷， 李昊泽， 曹学丽

(北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/北京工商大学 轻工科学技术学院， 北京 100048)

调制乳是以不低于80%的生牛(羊)乳或复原乳为主要原料，添加其他原料或食品添加剂或营养强化剂，采用适当的杀菌或灭菌等工艺制成的液体产品[1]。调制乳中含有脂肪、蛋白质、乳糖、灰分，还有一些矿物质、维生素、天然的酶类等，还可以强化部分营养物质，例如钙、铁、锌和维生素D等，使其含量高于纯牛奶产品，满足不同人群的多样化需求。同时香精的加入也为产品赋予了不同风味，市面上比较常见的是香蕉风味、巧克力风味和草莓风味的调制乳。

食品用香精是指由食品用香料与食品用香精辅料组成的用来起香味作用的浓缩调配混合物[2]。香料，是一种能被嗅感嗅出气味或味感品出香味的物质，是用以调制香精的原料，分为天然香料和人造香料。香精在调制乳中使用普遍，可起到提供、补充、稳定风味的作用[3]，我国乳制品中香精的使用依据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》进行，可按生产需要适量添加，并无限量规定。由于其使用具有“自我限量”的特性，用量较低[4]，其安全性经常被人们忽视。但是也有大量研究表明，一些香精成分如果大量使用或接触是存在安全风险的[5-11]。

香精在调制乳中的添加情况十分普遍，除了奶味香精外，各种果味香精及其他多种香精的使用构成众多风味的调制乳。但是目前关于调制乳中香精成分的含量及其安全性关注较少。前期本实验室通过对我国乳制品中常用香精的组成成分进行分析，依据毒理学数据、检出率及相对含量，共筛选出19种香精关注成分[12]。本研究首先采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法对市售调制乳样品中的19种香精关注成分的含量进行了大样本量分析，然后基于对于不同人群调制乳日摄入量的调查结果，对其暴露水平和安全风险进行了评估。希望该研究对于了解我国调制乳中香精的使用现状具有一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

调制乳中19种香精关注成分：反-2-已烯醛、己酸烯丙酯、芳樟醇、4-萜烯醇和菠萝酯的质量分数大于98.0%，2,3-丁二酮、乳酸乙酯、麦芽酚、乙基麦芽酚、邻氨基苯甲酸甲酯、香兰素和苯甲酸苄酯的质量分数大于99.0%，正己醇、苯甲醛、苯甲酸乙酯、乙酸苄酯、苯甲醇、苯乙醇和丁香酚的质量分数大于99.5%，阿拉丁试剂(上海)有限公司。

乙醇(质量分数大于等于99.8%)，阿拉丁试剂(上海)有限公司。

通过市场和网购的方式采购了25种乳制品品牌的共100个调制乳样品。

1.2 仪器与设备

PC- 420D型固相微萃取平台，美国Corning公司；7890B- 7000C型气相色谱串联质谱仪，美国Agilent科技有限公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)型萃取纤维头，美国Supelco公司；电子分析天平，DENVER公司。

1.3 实验方法

1.3.1调制乳中香精关注成分的定量分析方法

1.3.1.1 标准溶液和基质标准样品的配制

取19种香精关注成分标准样品分别用乙醇配制成一定浓度的单体标准溶液，然后再配制成混合标准溶液，逐级稀释后，置于冰箱4 ℃贮存备用。分析前，取一定体积的不同浓度的混合标准溶液，以一个本底干净的不添加任何其他物质的生牛乳样品作为空白基质，制备系列含基质标准样品。该生牛乳样品经SPME- GC- MS/MS(MRM)检测，除含有少量的2,3-丁二酮和苯甲醛外，不含有其他目标成分。少量的两种成分在做标准曲线和加标回收率计算时进行了折算。

1.3.1.2 样品前处理方法

取1 g乳样品，加4 g纯净水于15 mL顶空瓶内，加入磁力搅拌转子，旋紧装有聚四氟乙烯/聚硅氧烷(PTFE/Silicone)盖垫的螺纹盖，置于固相微萃取平台上。设置萃取温度为60 ℃，转速为400 r/min，预热搅拌平衡10 min；插入老化好的萃取头，并保证纤维头萃取部分距离液面1.5 cm；萃取50 min后取出，立即插入GC进样口(温度250 ℃)，解析时间5 min。

1.3.1.3 GC- MS/MS分析条件

GC检测方法。HP- INNOWAX型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；载气为高纯氦气(99.999%)；恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样口温度为250 ℃；不分流进样。升温程序：初始温度为50 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 升至95 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升至150 ℃，最后以6 ℃/min升温到230 ℃，保持10 min。

MS/MS检测方法。电子轰击离子源(EI源)；离子源温度250 ℃；四极杆温度150 ℃；辅助加热区温度250 ℃；电子能量70 eV；溶剂延迟5 min；质谱扫描范围(m/z)29～300 u；多反应监测(MRM)模式下，19种香精关注成分的母、子离子对及碰撞电压设置见表1。

表1 MRM模式下调制乳中19种香精关注成分质谱分析参数设置

1.3.1.4 定量分析方法

采用外标法进行定量分析。不同浓度的生牛乳基质标准样品，采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法进行分析，以平均峰面积为纵坐标，以样品中香精关注成分的浓度为横坐标，绘制19种成分的标准曲线。其中19种成分的浓度以实际样品中的含量为参照而定。

1.3.2调制乳中香精关注成分的暴露水平评估方法

首先采用中国农业科学院农产品加工研究所通过问卷所得不同人群调制乳日摄入量的调查结果，调查人数2 121人，分儿童、女性组和男性组3组人群进行统计，分别得到全人群人均日调制乳摄入量和3个不同人群人均日调制乳摄入量。

按式(1)计算香精关注成分的人均日摄入量(per capita daily intake，PCI)。

PCI=F×w。

(1)

式(1)中，PCI为香精成分人均日摄入量，μg/(人·d)；F为人均调制乳日摄入量，kg/(人·d)；w为香精成分测得的质量分数，μg/kg。

1.3.3调制乳中香精关注成分的安全风险评估方法

在暴露水平评估基础上，依据毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC)进行安全风险评价。TTC是将各物质通过化学结构等进行评估和分类，共分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，其对应3种不同的人体暴露阈值，分别为1 800、540、90 μg/(人·d)，当某个物质的人体暴露量低于该物质的阈值时，认为其可能产生的安全风险很低，无须对其进行安全性评价。该方法是FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)、欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)、食品香料萃取物制造者协会(Flavour Extract Manufacturers’Association，FEMA)等机构均采用的安全性评估方法[13-15]。

1.4 数据处理

调制乳样品的分析中，每个样品重复分析3次，采用Microsoft Excel进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 方法学评价结果

表2给出了调制乳中19种香精关注成分的线性方程、线性范围、相关系数(R2)、定性检测限(LOD，3倍信噪比)、定量检测限(LOQ，10倍信噪比)、日内精密度(1 d之内连续3次进样的相对标准偏差)和日间精密度(连续3 d测定的相对标准偏差)。结果表明：19种关注成分在相应质量浓度范围内呈良好的线性关系(R2≥0.990 1)，日内精密度小于等于9.03%，日间精密度小于等于9.90%。

表2 SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析调制乳中19种香精关注成分的线性范围、检测限和精密度

以生牛乳样品为基质进行加标回收实验，向样品中分别添加3个不同浓度梯度的混合标准溶液(低、中、高浓度范围)，进行加标回收率测定，结果见表3。方法平均回收率在86.48%～109.74%，平均相对标准偏差(RSD)在4.41%～8.55%。方法学验证结果基本满足定量分析要求，说明利用SPME- GC- MS/MS(MRM)法对调制乳中香精关注成分进行定量分析是可靠的。

表3 SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析调制乳中19种香精关注成分的加标回收率

续表3

2.2 调制乳中香精关注成分的定量分析结果

图1展示了SPME- GC- MS/MS(MRM)法分析调制乳中19种香精关注成分混合标准样品和某调制乳样品的总离子流色谱图。对25个品牌100个调制乳样品中的19种香精关注成分的定量分析统计结果见表4。

表4 100个市售调制乳样品中19种香精关注成分的含量

图中峰编号同表1。

通过对定量分析结果的统计分析可知：

1)19种关注成分中，检出率最高的是苯甲醛和2,3-丁二酮，分别为100%和96%。苯甲醛和2,3-丁二酮是牛(羊)乳本身就含有的成分，在本研究中虽然无法分辨是本身含有还是后期添加或产生的，但与一些不加食用香精的纯牛奶样品相比，调制乳中这两个物质的含量要远高于纯牛奶。其次，检出率大于80%的有2个：芳樟醇(88%)和正己醇(86%)。

2)19种关注成分中，平均含量大于1 000 μg/kg的关注成分有4个：香兰素(18 886.03 μg/kg)、乙基麦芽酚(6 271.15 μg/kg)、麦芽酚(2 522.64 μg/kg)和苯甲醇(1 937.60 μg/kg)。其检出率分别是47%、71%、40%和30%。

3)从定量分析结果的数值上能够看出香精成分在不同的样品中的含量差异很大，即使相同口味的样品，不同品牌之间也存在很大的差异。同时发现，一些具有特征香气的关注成分，在某些口味样品中含量比较大，如苯甲醛在核桃口味的样品中、己酸烯丙酯和菠萝酯在香蕉和芒果口味的样品中、苯乙醇在巧克力味的样品中、丁香酚和乙酸苄酯在香蕉味样品中、香兰素在香草味和巧克力味样品中含量较多。

2.3 调制乳中香精关注成分的暴露水平评估结果

表5为不同人群调制乳日摄入量问卷调查的统计结果，将其分为儿童、女性组和男性组3组人群进行统计。计算全人群人均每日调制乳摄入量为46.253 g，人均体重为60.233 kg。据此计算香精关注成分的全人群人均摄入量(PCI)见表6。同理，可以依据不同人群的人均调制乳摄入量，计算不同人群的PCI，表7列出了不同人群的最大PCI值。

表5 不同人群调制乳日消费量

表6 调制乳中19种香精关注成分全人群PCI及其与TTC的比较

2.4 调制乳中香精关注成分的安全风险评估结果

将全人群的人均日摄入量PCI与TTC作对比，见表6，其中超出数为超出TTC的个数，超出率为超出数除以检出数，表6中加粗部分数据表示暴露量超出TTC。由表6可知，基于全人群人均每日调制乳摄入量为46.253 g进行评估，本研究中的100个调制乳样品中的香精关注成分，按平均PCI计算均小于对应的毒理学关注阈值TTC，显示无风险；按最大PCI计算，超出TTC的有4个，按超出率从高到低分别是乙基麦芽酚(16.90%)、香兰素(12.77%)、麦芽酚(2.50%)和芳樟醇(1.44%)。

将不同人群的最大PCI[μg/(人·d)]与对应的TTC[μg/(人·d)]比较，见表7。表8统计出了几种超出TTC的香精关注成分在各人群中的情况。苯甲醇仅在男性60岁以上的人群分组中有3.3%的超出率；芳樟醇和麦芽酚分别在一些人群中有超出，超出率低于10.0%；乙基麦芽酚和香兰素在所有消费人群分组中均有超出情况，而且在男性60岁以上的消费人群中的超出率最高(39.4%和31.9%)。提示以各人群的平均调制乳摄入量计算，某些人群存在一定的风险，但是总体风险较低。

表7 调制乳中19种香精关注成分不同人群PCI及其与TTC的比较

表8 基于TTC的不同消费人群的安全性评价

3 结 论

本研究采用SPME- GC- MS/MS(MRM)法对25种品牌共100个调制乳样品中的19种香精关注成分进行了定量分析，并依据毒理学关注阈值进行了安全风险评价。结果表明：19种关注成分中，检出率最高的是苯甲醛和2,3-丁二酮，分别为100%和96%，其次是芳樟醇(88%)和正己醇(86%)。19种关注成分中，平均含量较高的有4种，分别是香兰素(18 886.03 μg/kg)、乙基麦芽酚(6 271.15 μg/kg)、麦芽酚(2 522.64 μg/kg)、苯甲醇(1 937.60 μg/kg)，其检出率分别是47%、71%、40%和30%。不同的样品中的含量差异很大，相同口味不同品牌之间也存在很大的差异。基于毒理学关注阈值TTC的风险评估提示，按全人群的调制乳人均日摄入量计算PCI，香精关注成分的平均暴露水平PCI均小于对应的毒理学关注阈值TTC，最大PCI超出TTC情况的有4个，超出率从高到低分别是乙基麦芽酚(16.90%)、香兰素(12.77%)、麦芽酚(2.50%)、芳樟醇(1.44%)。按不同人群的调制乳人均日摄入量，计算各人群的最大PCI，乙基麦芽酚和香兰素在所有消费人群分组中均有超出情况，而且在男性60岁以上的消费人群中的超出率最高(39.4%和31.9%)，此外，麦芽酚、芳樟醇和苯甲醇在一定人群中也有超出TTC的情况。全人群和不同人群的暴露分析均显示，存在一定的乙基麦芽酚和香兰素暴露风险，不同人群的风险不同，但总体安全风险较低。此外，本文的研究是基于一定数量的市售产品和一定范围的消费人群摄入量调查进行的，评价结果具有一定参考价值。