淡竹叶多肽的提取及抑菌性研究

◎ 李 琴，王 倩，潘丽燕，蒋 行，鲍会梅

（江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223003）

淡竹叶（Lophatherum gracileBrongn.）是禾本科，属多年生草本植物，富含多酚、黄酮、多糖、三萜类等生物活性物质[1]。《本草纲目》记载了淡竹叶这种草药具有多种药理活性，包括利尿作用及舒缓心脏压力、口腔溃疡和烦躁不安[2]。除作药用外，淡竹叶还可应用于食品、保健品等领域[3]。

目前的果蔬防腐保鲜方法通常是物理法和化学法，但都有一定的缺点。例如，物理法使用冷藏，成本高，而化学法使用化学杀菌剂存在一定的潜在毒性[4]。植物源抑菌剂通常是来源于天然植物中的一些生物活性物质，相比较于人工合成的抑菌剂，植物源抑菌剂安全性高、毒副作用小且绿色环保，具有较高的开发潜力和广阔的应用前景[5]。

当前，对于药食同源的原料淡竹叶的研究集中于其药理作用和其中活性物质如黄酮的提取与活性研究[6-7]，而对淡竹叶中多肽的研究鲜有报道。本研究对淡竹叶多肽进行提取并测其抑菌活性，为淡竹叶多肽作为天然抑菌剂的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淡竹叶：八仙村野生草药坊店铺购买；碱性蛋白酶：夏盛（北京）生物科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、牛血清蛋白、葡萄糖、三氯乙酸、蛋白胨和牛肉膏：国药集团化学试剂有限公司；酵母菌、青霉菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌：南京汉欣微生物实验室。

1.2 仪器与设备

101-3BS粉碎机：永康市圣象电器有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；KH5200B超声波清洗仪：昆山禾创超声仪器有限公司；TDL-5M离心机：湘仪离心机仪器有限公司；UV-2700紫外分光光度计：岛津公司；HH-4水浴锅：常州国华电器有限公司；LMQC-100E高压灭菌锅：山东新华医疗器械有限公司；SW-CJ-2F超净工作台：苏净安泰空气技术有限公司。

1.3 淡竹叶多肽的提取及工艺优化试验

1.3.1 淡竹叶预处理

将淡竹叶于45 ℃烘箱中干燥1～2 d，用粉碎机充分打磨成粉末后，过60目筛。利用环己烷进行脱脂，干燥密封保存。

1.3.2 淡竹叶蛋白的制备

称取一定量的淡竹叶粉置于烧杯中，加入水，调节料液比为1∶15，pH为9.5。60 ℃水浴超声（400 W）提取2 h。提取结束后，在转速4 800 r·min-1下离心20 min取上清。然后调节上清pH为5.0，4 800 r·min-1离心20 min，收集沉淀，用去离子水洗涤3次，冷冻干燥得淡竹叶总蛋白。

1.3.3 淡竹叶多肽的制备

淡竹叶多肽的制备流程为淡竹叶→预处理→制备淡竹叶蛋白→酶解淡竹叶蛋白→灭酶（沸水浴15 min）→冷却→离心（4 500 r·min-1，20 min）→旋转蒸发→冷冻干燥。

1.3.4 淡竹叶多肽含量及得率的测定

采用比色法[8]测定多肽含量，配制0 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1和 1.4 mg·mL-1的 Gly-Gly-Tyr-Arg 四 肽标准溶液。分别取标准溶液2 mL，双缩脲试剂8 mL，振荡混匀，静置45 min后，取上清液于540 nm下测定吸光度值。样品测定时，往样品溶液中加入等体积10%的三氯乙酸溶液，混匀静置30 min后，离心15 min（4 000 r·min-1），取上清液2 mL，按标准溶液测定方法操作得到吸光度值。以多肽含量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线为y=0.063 8x+0.002 8，R2=0.996 3。多肽得率计算公式为

式中：V为样品溶液体积，mL；C为样品溶液多肽的浓度，mg·mL-1；m为原料中蛋白质的含量，mg。

1.3.5 酶解淡竹叶蛋白试验设计

选取碱性蛋白酶，料液比为1∶15，设计单因素试验探究酶解温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、酶解时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h）、酶 解 pH（7.5、8.5、9.5、10.5和 11.5）、 加 酶 量（3 000 U·g-1、4 000 U·g-1、5 000 U·g-1、6 000 U·g-1和7 000 U·g-1）对酶解效果的影响，确定酶解制备淡竹叶多肽的最佳条件。

利用Design-Expert 8.0.6软件，设计4因素3水平的响应面分析试验。响应面试验因素与水平设计如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表

1.4 抑菌活性检测

1.4.1 菌种的活化培养

参考曹阳等[9]的方法，将青霉菌、酵母菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌分别放置于相应的培养基中培养。无菌条件下，分别挑取5环菌株置于对应的液体培养基中，分别在28 ℃和37 ℃下培养24 h和48 h备用。

1.4.2 淡竹叶片多肽液抑菌效果的测定

采用滤纸片法[10]对淡竹叶多肽的抑菌性进行测定，并稍作修改。将打孔灭菌处理过的滤纸片分别置于0%、20%、40%、60%、80%和100%的淡竹叶多肽提取液中，浸泡5 h。将菌悬液接种到各个固体培养基上。取出浸泡的滤纸，放入各介质中，用十字交叉法测定抑菌圈直径。抑菌性指标由抑菌圈直径来衡量。

2 结果与分析

2.1 淡竹叶多肽制备工艺优化

2.1.1 单因素试验结果

图1显示了酶解各因素对淡竹叶多肽得率的影响。图1a表明，随着酶解温度的升高，多肽得率呈现先升高后降低趋势。当酶解温度在30～50 ℃时，酶活性能被最大限度地激活，酶解反应加快，多肽得率也大大提高。酶解温度为50 ℃时，多肽得率达到最大。但当酶解温度过高时，酶的活性会降低，因此确定最佳酶解温度为50 ℃。图1b表明，多肽得率随酶解时间的延长而呈现先升后降的趋势，酶解2 h时多肽得率达到（7.78±0.25）%。再继续酶解，多肽得率并未增加，推测原因是溶液中底物浓度达到饱和[11]，因此确定酶解最适时间为2.0 h。pH的改变会影响酶活力部位的带电情况，从而影响酶与底物的结合。由图1c可知，淡竹叶蛋白在碱性环境下酶解效果较好，最适的pH为9.5[12]。由图1d可知，随着加酶量的增加，多肽得率先增加后减少，当加酶量为5 000 U·g-1时，多肽得率最高，可达（7.85±0.21）%。这是因为在底物充足的条件下，酶反应的速率与酶浓度成正相关，而当酶浓度过高时，酶分子之间可能发生相互水解，导致酶活力下降[13]。

图1 酶解各因素对多肽得率的影响图

2.1.2 响应面试验设计及结果

响应面试验设计及结果见表2。多元回归方程的方差分析结果见表3。对数据进行方差分析，得到方差的显著性检测和回归方程为多肽得率=7.86+0.19A+0.26B+0.48C+0.45D+0.087AB-0.085AC-0.140AD+0.050BC+0.060BD+0.11CD-0.80A2-1.12B2-0.87C2-0.47D2。由表3可知模型显著，说明模型拟合度高，可用来对本试验结果进行优化。各因素的显著性显示，酶解温度、酶解时间pH和加酶量对酶解提取多肽的工艺有极显著的影响（P＜0.01）。

表2 响应面试验设计及结果表

表3 多元回归方程的方差分析表

2.1.3 响应面分析

响应曲面开口朝下，说明响应值存在极大值点。等高线图可反映两因素间交互作用的强弱。等高线形状为椭圆形和圆形分别表示两因素之间交互作用显著和不显著[14-15]。

由图2～图4可知，淡竹叶多肽得率随着酶解温度、时间、pH的增加呈现先升高后降低的趋势，存在极大值。图2～图4中AB、AC、BC等高线似圆形，表明彼此间相互作用较弱，与表3中得到的方差分析结果一致。

图2 酶解温度和酶解时间对淡竹叶多肽得率影响图

图3 酶解温度和pH对淡竹叶多肽得率影响图

图4 酶解时间和pH对淡竹叶多肽得率影响图

2.1.4 最佳提取工艺验证

根据响应面模型，获得的淡竹叶多肽的最佳提取工艺模型为酶解温度50.06 ℃、酶解时间2.14 h、pH值9.81、加酶量5 525 U·g-1。通过最佳提取工艺，淡竹多肽得率达到8.07%。为验证回归模型的可靠性，将条件修正为酶解温度50 ℃、酶解时间2 h、pH值9.8、加酶量5 525 U·g-1进行3次平行验证试验，结果为（7.95±0.15）%。试验结果接近预测值，说明此响应面优化工艺用于提取淡竹叶多肽是可行的，回归模型和实际值契合性较好。

2.2 抑菌活性试验结果

由表4可知，淡竹叶酶解产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有较好的抑菌效果，对酵母菌和青霉菌抑菌效果不明显。随着淡竹叶多肽液的体积分数增大，对5种菌的抑制作用也在不断增强。前人在研究淡竹叶提取物抑菌防腐作用时，发现其对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌都具有一定的抑菌效果，且对金黄色球菌抑制效果最强，而对青霉抑菌效果不明显[16]。江惠[17]在研究竹叶天然多肽的抑菌效果时发现，竹叶多肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有良好的抑菌作用，且对前两种菌种的抑制作用最强，本文研究结果与其相似。

表4 抑菌活性试验结果表

3 结论

以淡竹叶为原料，通过碱性蛋白酶酶解法制备得到淡竹叶多肽。响应面法优化得到最佳提取工艺为酶解温度50 ℃、酶解时间2 h、pH为9.8、加酶量5 525 U·g-1，在此条件下，淡竹叶多肽的得率达到了（7.95±0.15）%。抑菌试验结果表明，淡竹叶多肽液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌具有较强的抑制作用，而对酵母菌和青霉菌抑制效果不明显。淡竹叶多肽可作为天然的抑菌剂添加到果蔬中，达到抑菌防腐的效果。