多功能针式过滤器净化-UPLC-MS/MS法同步测定香蕉全果、果肉及叶中9种植物生长调节剂残留

覃国新，李慧玲，周其峰，杨玉霞，何洁，韦宇宁，王海军，陈泳锨，王天顺，陈伟，黄曲燕

（1.广西壮族自治区农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所，农业部甘蔗品质监督检验测试中心(南宁)，广西南宁 530007）（2.广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所，广西南宁 530007）

香蕉是全球重要的热带水果之一，也是消费量和贸易量名列前茅的水果品种之一[1,2]。我国是香蕉第二大生产国，香蕉消费量在总水果消费量中排名第4[1,2]。香蕉已成为农业生产国非常重要的粮食和经济作物，在提高农村经济收入中起关键性的作用。因此，香蕉鲜果的产品质量安全一直备受关注，然而长期以来人们的关注点在于香蕉中的农药残留，忽视了香蕉及香蕉叶中的植物生长调节剂（Plant Growth Regulators，PGRs）残留。PGRs 是一类广泛用于现代农业种植的植物激素化合物，它们可以促进或者抑制植物的生长，可以调节植物的生长发育过程[3,4]。但若其在香蕉及香蕉叶中残留量过高，不仅可致畸致癌、影响心机功能等毒副作用，而且会对生态环境会造成不可估量的毒害[5]。然而，目前我国国家标准未规定有香蕉中PGRs的残留限量值以及检测标准。所以，建立快速检测香蕉产品中PGRs 残留的分析方法具有重要意义。

目前，对果蔬农产品中植物生长调节剂残留的检测方法主要有液相色谱-串联质谱法[6-8]、液相色谱法[9]、气相色谱-串联质谱法[10]。前处理技术主要有固相萃取法[11,12]、简单、快速、安全、价格低廉的分散固相萃取净化法（Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe，QuEChERS）[13,14]等。近年来，基于QuEChERS原理，报道了通过式固相萃取前处理净化技术[15,16]，覃国新等[17]基于通过式固相萃取净化技术，建立了同步测定蔬菜中克百威和涕灭威及代谢物残留的检测方法，该净化方法明显缩短了样品前处理时间，具有方便、快捷等优点。多功能针式过滤器净化是在通过式固相萃取技术的基础上，将样品提取溶液的净化和过滤集于一步完成而建立的农药多残留检测样品前处理技术[18]，相对于QuEChERS 法，多功能针式过滤器净化方法节省了振摇净化及离心的多个环节，极大地提高了检测效率。

常见的用于果蔬种植中的植物生长调节剂主要有矮壮素、缩节胺、多效唑、丙环唑、抗倒酯、氯苯胺灵、氯吡脲、烯效唑、抑芽丹、芸苔素内酯、吲哚乙酸、吲哚丁酸、噻苯隆、胺鲜酯、赤霉素等。但我国国家标准GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中仅规定了2,4-D、矮壮素、胺鲜脂、单氰胺、丁酰肼、多效唑、氟节胺、复硝酸钠、甲哌鎓（助壮素）、抗倒酯、氯苯胺灵、氯吡脲、萘乙酸、噻苯隆、噻节因、四氯硝基苯、调环酸钙、烯效唑、乙烯利和抑芽丹等20 种PGRs 在部分果蔬中的残留限量标准及检测标准，目前尚未见采用多功能针式过滤器净化方法对香蕉全果、香蕉果肉及香蕉叶中烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、芸苔素内酯、丙环唑和氯吡脲等9 植物生长调节剂残留检测前处理的研究报道。因此，本实验建立了多功能针式过滤器净化-超高效液相色串联质谱同步检测香蕉全果、香蕉果肉和香蕉叶中烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、芸苔素内酯、丙环唑和氯吡脲9 种植物生长调节剂残留的分析方法。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

Xevo TQ-S 型超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱用仪（UPLC-MS/MS）配有电喷雾离子源，美国Waters 公司；DS-1 型高速组织捣碎机，上海标模仪器厂；LD5-2A 型离心机，北京京立离心机有限责任公司；多功能针式过滤器（含150 mg MgSO4、50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、50 mg 十八烷基键合相硅胶（C18）），天津阿尔塔科技有限公司；

烯效唑（纯度≥98.0%，m/m）、多效唑（纯度≥98.8%，m/m）、噻苯隆（纯度≥99.4%，m/m）；胺鲜酯（纯度≥99.7%，m/m）、吲哚丁酸（纯度≥99.5%，m/m）、吲哚乙酸（纯度≥99.6%，m/m）、芸苔素内酯（纯度≥98.0%，m/m）、丙环唑（纯度≥99.0%，m/m）、氯吡脲（纯度≥99.5%，m/m）、乙酸（色谱纯），上海安普实验科技股份有限公司；乙腈（色谱纯），赛默飞世尔（中国）科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量的9 种待测化合物标准品，用乙腈配制成浓度为1 000 mg/L 的标准储备液；准确移取9种标准储备液，用乙腈稀释成浓度为10.0 mg/L 的标准中间混合溶液；使用时用乙腈或者空白基质提取净化液逐级稀释至所需要的浓度。

1.3 样品前处理

提取：取香蕉全果、香蕉果肉和香蕉叶试样，采用组织捣碎机捣碎制备得到混合均匀的样品，称取10.00 g，加入20.0 mL 体积分数1%乙酸乙腈，涡旋提取1 min，加入3 g 氯化钠，再涡旋提取1 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清液待净化。

净化：取上述上清液1.5 mL 以2 滴/s 的速度通过多功能针式过滤器于进样瓶中，供UPLC-MS/MS 测定。

1.4 超高效液相色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm），美国Waters 公司；流动相A：0.1%甲酸溶液，流动相B：乙腈。梯度洗脱程序为：0～0.8 min，90% A；0.8～1.8 min，90%～70% A；1.8～3.8 min，70%～50% A；3.8～5.5 min，50%～30% A；5.5～7.0 min，30%～10% A；7.0～8.5 min，10% A；8.5～ 9.2 min，10%～50% A；9.2～9.6 min，50%～90% A；9.6～10.0 min，90%；柱温35 ℃，流速0.25 mL/min，进样体积2.0 μL。

1.4.2 质谱条件

采用电喷雾ESI+离子源和多反应监测（MRM）的模式；脱溶剂气温度350 ℃，电喷雾电压3.0 kV，离子源的温度为150 ℃，脱溶剂的气体流速为700 L/hr。在仪器检测分析过程的中，以母离子和两个子离子的信息比较来定性分析；用母离子及响应值最高的子离子来定量分析。9 种PGRs 的多反应监测模式质谱参数如表1所示。

表1 9 种植物生长调节剂的质谱分析参数Table 1 MS/MS analysis parameters for the 9 PGRs

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的确定

2.1.1 质谱条件的优化

由于9 种PGRs 中绝大多数化合物属于含氮的碱性化合物，根据目标化合物的性质，在质谱扫描时碱性化合物适合选择正离子（ESI+）模式扫描。因此，本实验采用正离子的扫描方式，以浓度大小为0.1 mg/L 的标准溶液扫描测定，优化了烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、芸苔素内酯、丙环唑和氯吡脲的母离子分别为m/z292.2、294.1、221、216、204、176、481.2、342、248.1。其它质谱参数见表1。

2.1.2 色谱条件的优化

当用正离子（ESI+）模式进行扫描时，加酸可以向待测化合物提供H+，以提高化合物在质谱中的响应值；实验考察了以甲醇及乙腈做为有机流动相的分离效果，当选用乙腈时9 种PGRs 的峰形更好且响应值更高，综合考虑，本文采用乙腈和0.1%甲酸作为流动相，并优化了流动相的梯度洗脱程序，以获得更好的分离效果。

在优化的色谱-质谱条件下，烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、芸苔素内酯、丙环唑和氯吡脲在香蕉全果、香蕉果肉和香蕉叶混合空白基质加标下的MRM 色谱图如图1，出峰时间依次为6.16、5.73、4.22、3.51、4.56、3.75、5.73、6.74、4.95 min，由图1可见，样品基质不干扰待测化合物的测定。

图1 9 种PGRs 在香蕉全果、香蕉果肉和香蕉叶混合空白基质加标（0.1 mg/kg）下的MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 9 PGRs of mixed blank samples of banana whole fruit,banana pulp and banana leaf spiked at 0.1 mg/kg level

2.2 净化方式的选择

目标物的提取及净化是植物源性样品农药残留测定的重要环节，其直接影响检测方法的重现性和回收率。本文采用体积分数1%乙酸乙腈涡旋提取，加入氯化钠，再涡旋提取，离心后，上清液直接经过多功能针式过滤器净化以吸附色素、蛋白质等干扰物质，与QuEChERS 分散固相萃取净化方式对比，本方法操作更简便，适合批量快速检测需求。

2.3 考察样品的基质效应

取不含待测PGRs 的香蕉全果、香蕉果肉和香蕉叶样品，经“1.3”方法处理，得到空白样品基质提取的净化溶液，用此溶液逐渐稀释10 mg/L 的混合标准溶液，配成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 和0.5 mg/L 的基质标准工作溶液。在以上优化的实验条件下上机检测，用目标物的质量浓度（X，mg/L）作为横坐标，相对应定量离子对的峰面积（Y）作为纵坐标制作基质标准曲线。基质校准曲线斜率与纯溶剂校准曲线斜率的比值即为基质效应（ME），当计算得到ME值越接近于1时，基质效应就越小，具体实验结果见表2。从表2可知，烯效唑在香蕉果皮、香蕉果肉和香蕉叶片中以及芸苔素内酯在香蕉果皮、香蕉果肉中的基质效应很大（ME＞1.7），胺鲜酯的基质效应较弱（ME值接近于1），其它化合物均存在程度不同的基质效应。这可能与化合物本身性质、待测样品基质及目标物离子化的效果有关，为减小基质效应，采用基质校准进行定量。

2.4 方法的线性范围、检出限及定量限

在上述优化的实验条件下，香蕉全果、香蕉果肉和香蕉叶中的烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、芸苔素内酯、丙环唑和氯吡脲在0.001～0.5 mg/L 范围内具有良好的线性关系（9 种PGRs 在香蕉全果中的基质标准曲线图如图2所示），不同基质标准曲线线性方程见表2，相关系数均大于0.999 2。以3 倍信噪比（S/N=3）计算得到9 种PGRs的检出限（LOD）分别为0.50、0.20、0.50、0.80、10.00、10.00、3.00、0.20 和4.00 μg/kg，以S/N=10计算得到其定量限（LOQ）分别为1.60、0.70、1.60、2.50、33.50足检测需要。

图2 不同质量浓度烯效唑(a)；多效唑(b)；噻苯隆(c)；胺鲜酯(d)；吲哚丁酸(e)；吲哚乙酸(f)；芸苔素内酯(g)；丙环唑(h)和氯吡脲(i)在香蕉全果中的线性关系Fig.2 Linear relationship of uniconazole (a); paclobutrazol (b);thidiazuron (c); diethyl aminoethyl hexanoate (d); indolyl butyric acid (e); indolyl acetic acid (f); brassinolide (g);propiconazole (h) and forchlorfenuron (i) with various concentrations in banana whole fruit

表2 香蕉果皮、香蕉果肉和香蕉叶片中9 种植物生长调节剂的基质效应Table 2 Matrix effects of 9 PGRs in matrix of banana whole fruit,banana pulp and banana leaf

2.5 回收率和精密度

取未检出有9 种待测目标化合物的香蕉全果、香蕉果肉及香蕉叶为空白样品进行加标回收实验（多功能针式过滤器和QuEChERS 对比），10 g 样品中9 种PGRs 的加标浓度分别为0.05、0.10、0.50 mg/kg。测定结果见表3。在香蕉全果、香蕉果肉及香蕉叶中，本方法的平均添加回收率在80.50%～113.00%，QuEChERS 法的平均添加回收率在80.70%～112.30%之间，两种方法的相对标准偏差（RSD）分别为0.40%～5.60%和1.00%～5.90%。可见，它们的回收率及精密度都达到要求，但多功能针式过滤器前处理净化法，集净化和过滤一步完成，省去了振摇分散净化及离心环节，简化了净化步骤、缩短了前处理时间，不但有效提高了检测效率，而且能很好除去提取液中色素、蛋白质等基质干扰物质，本方法更简便、快捷。

表3 检测样品中9 种植物生长调节剂的平均加标回收率与相对标准偏差（n=6）Table 3 Average spiked recoveries and RSD (n=6) of 9 PGRs in real samples

2.6 实际样品的检测

从种植地中取10 份香蕉及对应的香蕉叶样品，按“1.3 节”处理，对其中的烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、芸苔素内酯、丙环唑和氯吡脲进行检测，均未检出有上述PGRs 残留。

3 结论

本研究建立了多功能过滤器净化-超高效液相色谱-串联质谱法同步测定香蕉全果、香蕉果肉及香蕉叶中烯效唑、多效唑、噻苯隆、胺鲜酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、芸苔素内酯、丙环唑和氯吡脲残留的分析方法。样品经1%（V/V）乙酸-乙腈提取，多功能针式过滤器一步式净化后，采用电喷雾ESI+离子源和多反应监测（MRM）的模式进行质谱测定。方法检出限（LOD）在0.20～10.00 μg/kg 之间，定量限（LOQ）在0.70～33.50 μg/kg 之间。该方法简便快捷，具有良好的准确度、灵敏度和精密度，适用于同步批量快速检测烯效唑等9种PGRs 在香蕉全果、香蕉果肉及香蕉叶片中的残留。