顶空固相微萃取-气相色谱-质谱/嗅闻仪结合电子鼻和多元统计方法对4种柠檬的风味差异分析

邓广牒，曹庸，聂稳，阚启鑫，胡海娥，李学莉，贺丽苹,3*

（1.华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性物重点实验室，广东广州 510642）（2.东鹏饮料（集团）股份有限公司，广东深圳 518055）（3.华南农业大学测试中心，广东广州 510642）

柠檬是芸香科柑橘属类植物果实，根据外观色泽可以分为黄色皮、青色皮两大类。在我国柠檬产地有四川、台湾、海南、两广以及福建等地区[1]，其中四川安岳气候温和，日照充足全年温差不大，其柠檬果质优良，享有“柠檬之都”美誉。柠檬不仅香气浓郁，而且含有丰富的维生素C、多酚、黄酮等物质[2]，具有抗氧化[2]、抑菌消炎[3]、抗肿瘤[4]等功效，在食品饮料、香精香料行业应用广泛。

柠檬的香气是反映柠檬品质的重要指标。目前，电子鼻[5]、GC-MS/O[6]等技术已经成为常用的香气分析手段[7,8]。何塞[6]利用GC-MS 对4 种柠檬挥发性成分进行比较，并鉴定出75 种挥发性成分，确定柠檬烯、月桂烯、萜品烯等为主要挥发性成分。张海鹏[9]利用GC-MS 对106 种柑橘进行挥发性成分分析并确定柑橘汁中162 种化合物，其中柠檬烯、柠檬醛以及蒎烯含量最高。冯仕[10]通过GC-MS/O 联用对荔枝挥发性化合物进行表征并鉴定出香叶醇、芳樟醇、呋喃醇为荔枝的关键香气成分。朱春华[11]利用GC-MS 分析不同品种柠檬精油挥发性成分进行比较，尤力克柠檬中柠檬烯、蒎烯、柠檬醛等特征香气成分高于其他品种。

上述风味研究均是仪器差异性分析，近年来综合因子得分被用于综合品质评价方面。综合因子得分是利用统计学分析方法将指标数据，通过计算降维后的特征值矩阵，进行主成分分析，确定其个数和表达量，最后计算样品在不同主成分上的得分，达到综合评价的效果，如傅隆生[12]利用主成分得分与聚类分析，分析不同种类猕猴桃的综合品质评价，结果显示，两种模式具有高度一致性。主成分综合得分分析最先应用在选优育种方向[12-14]，也逐渐应用于农产品、食品品质评价和质量控制方面，如石彦国等[15]通过分析45 种不同大豆的理化指标和表观特性，通过主成分综合得分结合感官评价筛选出5 种适合蒸煮加工的大豆；李丽梅通过接种不同酵母于雪花梨中，以总酸、多酚、pH等理化指标，利用因子得分计算得出酿酒酵母LA-BA所酿梨酒的综合品质最好[16]；张颖颖等[17]通过主成分综合评价对黑、白芝麻酱进行品质判别，结果显示白芝麻综合得分高于黑芝麻，与感官评价结果一致，综上主成分得分评价是一种客观的综合评价方法。由于柠檬品种丰富，不同柠檬风味成分、品质质量差异较大，全方位多手段研究柠檬挥发性风味差异，对柠檬的综合利用具有重要意义，目前对于柠檬的风味研究仅使用单一技术手段[18,19]，对柠檬关键香气成分多种技术联合分析以及多元统计综合评价体系缺乏报道。

本文以安黄柠檬（AH）、安青柠檬（AQ）、香水柠檬（XS）以及海南青柠檬（HQ）为原料，通过顶空固相微萃取- 气相色谱- 质谱联用/ 嗅闻仪（HS-SPME-GC-MS/O）结合电子鼻对四种柠檬挥发性风味进行分析。结合ROAV 值确定柠檬中关键风味组分，通过测定不同品种柠檬理化特性，并对果肉中的多酚黄酮进行定性与定量，进一步计算主成分综合得分，建立不同品种柠檬原材料综合评价体系，以此对不同品种柠檬进行综合的风味差异判定。

1 材料与方法

1.1 原料

柠檬样品由东鹏特饮有限公司提供，分别采自四川省资阳市安岳县的安岳青柠檬（AQ）和安岳黄柠檬（AH）、海南省海口市秀英区的海南青柠檬（HQ）、广东省肇庆市播植镇的香水柠檬（XS）四种品种。正构烷烃C7-C20混合标准品，美国O2SI 公司；环己酮（色谱级）、甲醇（色谱级）、丁香酸、圣草次苷、橙皮苷（色谱级）均为麦克林公司；氯化钠、抗坏血酸、2,6-二氯靛酚、福林酚、碳酸钠等分析纯试剂。

1.2 主要仪器设备

6890-5973 N 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；LC-15C 液相色谱仪、SPD-M20A 紫外/可见检测器、SIL-10AF 自动取样器（配备Diamonsil 5µm C18(2)，25×4.6 mm），日本岛津公司；10 种金属氧化物半导体感应器的PEN3 系统（Airsense Analytics GmbH，Schwerin，Germany）电子鼻，德国Airsense 公司；CAR/PDMS 固相微萃取纤维头（75 µm），美国sigama 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 柠檬理化特性指标的测定

新鲜柠檬自采摘后立即榨汁，装入聚乙烯真空包装袋放置-80 ℃。分别对不同品种柠檬的指标测定。pH测定：参照GB/T 10468-1989 方法测定。总酸测定：参照GB/ 12456-2021 食品安全国家标准 食品中总酸的测定。固形物含量测定：参照GB/T 12143-2008 饮料通用分析方法中可溶性固形物的测定。维生素C 的测定：参考GB/ 5009.86-2016 第三法；2,6-二氯靛酚滴定法进行测定。

多酚的测定：分别将不同品种的柠檬的果皮和果肉分开，果肉榨汁冷冻干燥粉碎过筛（200 目），称取0.25 g 冻干粉末加入25 mL 体积分数80%甲醇，超声提取30 min，在5 000 r/min 转速下离心15 min，取上清液备用。采用上述的同样操作对沉淀进行二次提取两次，合并两次上清液定容至50 mL。采用福林酚法测定总酚，结合高效液相法测定多酚种类和含量。将样品各种多酚的保留时间和标准品的保留时间进行对比并进行定性，外标法（R2≥0.99）对不同柠檬品种中各种酚与黄酮含量进行定量。

1.3.2 柠檬挥发性风味成分测定

1.3.2.1 电子鼻对不同品种柠檬汁风味分析

参考Chen 等[20]的方法并略作修改，准确称取6.0 g的不同品种柠檬果汁，置于25 mL 顶空瓶中，室温下平衡30 min。将Luer-Lock 针插入样品顶空瓶中，过滤的空气以120 mL/min 的恒定速率泵入传感器阵列，测量持续300 s。10 个传感器的响应值描述如下。

1.3.2.2 HS-SPME-GC-MS/O 对柠檬挥发性香气成分提取与分析

（1）HS-SPME 香气成分提取

参考Gao 等[21]的方法略作修改，称取6 g 果汁于25 mL 螺口顶空样品瓶中，加入4 g 氯化钠和1 µL 内标环己酮，用聚四氟乙烯隔垫密封，在45 ℃磁力搅拌器上加热平衡5 min 后，用75 µm CAR/PDMS 萃取头萃取45 min 后，解吸5 min。

（2）GC 条件

色谱柱：DB-WAX 毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 µm）；进样口温度：260 ℃；载气（N2）流量：1 mL/min；升温程序：初始温度70 ℃，保持2 min，以4℃/min 速率升至210 ℃，保持10 min。

（3）MS 条件

四极杆温度150 ℃，电子轰击离子源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，质量扫描范围m/z：35～500。根据总离子流图和出峰时间、谱库（NIST 08 谱库）、保留指数进行定性，添加环己酮内标进行定量。

（4）嗅闻仪条件

MS 四极杆温度150 ℃，电子轰击离子源，传输线温度280 ℃，电子能量70 eV，扫描范围同MS 条件。嗅闻口与MS 端的分流比例为1:1，嗅闻口温度260 ℃，GC-MS/O 分析由5 名成员分别对样品进行嗅闻描述，记录气味特征及保留时间。

1.3.3 数据处理

1.3.3.1 GC-MS 定性与定量

以C7-C20饱和烷烃作为标准，用相同的升温程序对正构烷烃进行分离与测定，计算所测试样品中各组分的保留时间指数（Kovats Retention Indices，RI），通过数据库检索及参考文献中相关物质的保留时间指数共同定性。以1 μL 环己酮为内标进行相对定量。

1.3.3.2 相对气味活度值（ROAV）计算

参考刘登勇[22]的计算方法，采用相对气味活度值（ROAV）评价各挥发性组分对柠檬样品风味的贡献，相对气味活度值的计算公式为：

式中：

CA——各风味组分相对百分含量；

TA——各风味组分感觉阈值；

Cstan——对样品风味贡献最大的风味组分的相对百分含量；

Tstan——对样品风味贡献最大的风味组分的感觉阈值。

ROAV＞1，表明该组分对样品的风味贡献最大，即为关键特征风味组分；0.1≤ROAV＜1，表明该组分会对样品风味起修饰作用；ROAV＜0.1，说明该组分对样品风味影响不显著，在一定范围内，ROAV越大说明该物质对总体风味贡献越大[23]。

所有数据使用SPSS 23.0 软件进行处理，采用t检验进行样品间显著性差异分析，SIMCA-P 14.1 进行主成分分析（PCA），Origin 2019 软件作图，实验结果以平均值±误差表示。

2 结果与讨论

2.1 不同品种柠檬的理化指标分析

柠檬在生长成熟过程中，果汁品质质量和香气含量亦会受到维生素C，总酸等理化指标的影响，不同品种柠檬汁的理化指标测定结果如表2所示，可以看出：4 个不同品种柠檬间的理化指标都存在显著差异（p＜0.05）。pH 值、总酸是影响柠檬加工品质的重要因素，总酸含量越高，果汁的储藏性越好，AQ 的总酸含量最高（4.59%），HQ 的总蒜最低（3.93%）。总酸、固酸比是评价柠檬口感与品质的重要指标，AH 的固酸比最高（1.79），AQ 的维生素C 含量最高（34.97 mg/100 g），其次是AH（31.48 mg/100 g）、XS（23.09 mg/100 g），最低的是HQ（30.17 mg/100 g），与洪林[24]研究尤力克柠檬在成熟期维生素C 含量结果一致。

表1 PEN3 电子鼻传感器及其性能描述Table 1 Performance description of PEN3 portable electronic nose sensor

表2 不同品种柠檬的理化指标结果分析Table 2 Analysis of physical and chemical indexes of different varieties of lemon

多酚可以抑制促炎因子的表达，从而减轻炎症反应，食用富含多酚的食物，可以减少心血管疾病的发生[25]。从表2可知，AH 多酚含量最高，HQ 最低。四川地区的AQ、AH 柠檬多酚含量显著性高于广东、海南两地柠檬（p＜0.05），与高炜研究结果一致[1]，原因可能是气候、土壤等条件会影响柠檬果肉多酚的积累。

利用高效液相色谱法对柠檬中主要多酚、黄酮化合物进行测定分析，结果也列于表2中。从结果可以看出：四种柠檬中丁香酸、圣草次苷以及橙皮苷的含量存在显著性差异（p＜0.05），其中丁香酸在XS 中的含量最高，在HQ 中含量最低；而圣草次苷在AH 中的含量最高，在HQ 中最低，分别为4 081.32、3 027.06、638.61、267.66 mg/kg。AH 含有橙皮苷最多，其次是HQ、AQ，最后是XS 柠檬，分别为1 010.25、573.74、568.91、223.35 mg/kg，与董昕颖[26]的研究结果一致。

2.2 不同品种柠檬的电子鼻分析

电子鼻是一种测定挥发性化合物风味敏感度的分析技术，样品中风味轻微的变化便会引起传感器响应值的差异[27]。4 种柠檬的风味雷达图结果如图1所示，电子鼻2、7、9 号感应器具有明显的响应，表明柠檬中氮氧化合物、芳香化合物对风味的贡献率较大，其中AH 在2 号感应器响应最高，说明氮氧化合物在AH中贡献较高，XS、AH、AQ 在9 号感应器中的响应值（20 左右）与HQ 的响应值（10 左右）差异较大，说明XS、AH、AQ 中有机硫、芳香化合物差异较大。

图1 不同品种柠檬风味轮廓图Fig.1 Flavor profile of different lemon varieties

主成分分析如图2所示，在PCA 空间分布图中显示了不同品种柠檬样品的挥发性成分。两个主成分贡献率分别为（61.74%和25.81%）总贡献接近87.55%，表明这两个主成分构成了4 种不同柠檬样品的主要特征信息。4 种不同柠檬数据点组间具有较好聚集性以及样品间具有一定分散性，即PCA 主成分分析可以有效区分不同柠檬风味。PC1 轴所示样品由XS＜AQ＜HQ＜AH 等排列降低，而在PC2 轴上样品HQ＜AQ＜XS＜AH 排列降低。其中XS 和AQ（主要分布在PC2 负半轴上）两样品在PCA 空间区域分布较为接近，即AQ和XS 柠檬风味成分具有一定的相似度。而HQ（主要分布在PC1 负半轴和PC2 正半轴上）和AH（主要分布在PC1 和PC2 正半轴上）两种柠檬在空间区域距离较远，亦与XS 和AQ 空间区域距离较远，即与XS、AQ 品种的挥发性成分相似度较低。

图2 不同品种柠檬挥发性物质的的PCA 图Fig.2 PCA of volatile compounds of different lemon varieties

2.3 不同品种柠檬GC-MS/O 数据分析

采用HS-SPME-GC-MS 分析了不同品种柠檬样品中的挥发性组分，图3为不同样品挥发性组分总离子色谱图（TIC），GC-MS 测定不同柠檬挥发性成分具体含量结果如表3所示。从中可以看出，4 种柠檬挥发性组分种类以及含量各不相同，总检出63 种挥发性组分，将其分为6 大类，即烯类44 种、醇类有5 种、醛类6种、酯类5 种、酮类2 种、酚类1 种。AH 中烯类组分占总挥发性成分的85.28%、AQ 中烯类占总挥发性成分的88.99%、XS 中烯类占总挥发性成分的74.53%、HQ 中烯类占总挥发性成分的98.25%。醛类在XS 中含量占总挥发性成分的（22.25%），在AH 中有4.79%。酯类在AH 中占总挥发性成分的含量为8.72%，而其他3 个品种中酯类含量均不高。酚类只在AQ 中有检出。4 种柠檬挥发性成分的差异较大，可能是由于各地区的气候、土壤、成熟程度的不同，导致结果差异。而AQ和AH 的差异集中在单萜烯含量的不同，可能是幼果不同处理导致含量的差异，以及单萜烯类在成熟过程中生成含氧萜烯类。

图3 不同品种柠檬GC-MS 总离子流图Fig.3 GC-MS total ion flow of different lemon varieties

表3 不同品种柠檬果汁挥发性成分GC-MS 结果分析Table 3 GC-MS analysis of volatile components of lemon juice of different varieties

续表3

通过GC-MS 测定4种不同品种柠檬挥发性组分中有13 种共有峰：主要有α松油烯、月桂烯、δ-杜松烯、β-红没药烯、松油烯、柠檬烯、合金欢烯、芳樟醇以及乙酸橙花酯等组分，将其分为烯类11 种、醇类1 种、酯类1 种。D-柠檬烯含量最高，尤其在AH 中最高，其次是AQ、XS，最后是HQ。柠檬烯是柑橘类水果中普遍存在的一种组分，不仅具有柠檬的清香气味、水果味[28]。而且具有抗菌和防腐等效果，被广泛用于治疗胃痛、乳腺癌等[29]。α蒎烯具有木香、树脂香[30]，有很好的抗菌活性[31]以及消炎镇痛等作用[32]。月桂烯具有草香、松树香[10]香蜡和香精气味以及天竺葵等香气[33]。α-萜品烯、萜品油烯具有松林香气[34]。芳樟醇具有抗菌、抗炎活性[35]、抗癌[36]等功能活性作用，并且具有浓郁的柑橘气味[36]紫丁香、铃兰与玫瑰花香、木香、果香等香气[10,37,38]。乙酸橙花酯呈现出玫瑰香气、花果香[33]，乙酸香叶酯具有玫瑰花般香[39]。

利用SIMCA-P 软件对不同品种柠檬挥发性成分进行主成分分析，结果如图4所示。PCA 两个主成分合计贡献率为69.47%，可以说明了原始数据69.47%的信息。二维空间分布可以观察到不同样品差异明显，AH、AQ、HQ 主要体现在PC2 上，而XS 与AH 主要体现在PC1，以及组内样本点相互靠拢说明重复性较好。即表明GC-MS 结合主成分分析能有效区分不同品种柠檬，为GC-MS 用于不同地区原料的溯源鉴别提供参考方法。

图4 柠檬挥发性成分的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of lemon volatile components

ROAV值是一种可以量化样品中挥发性风味组分对整体香气贡献值的指标，从表4可以看出：ROAV＞1的风味化合物有8 种，分别为柠檬烯、罗勒烯、合金欢烯、芳樟醇、桉叶油醇、辛醛、壬醛、柠檬醛以及癸醛，是柠檬中的关键风味物质，具有明显的柑橘、柠檬果香等香气，是呈现柠檬香气的主要化合物。而0.1＜ROAV＜1 的有5 种，是柠檬中的修饰性风味化合物。其中AH 柠檬中柠檬烯和壬醛的贡献值高于其他品种，表现出浓郁的柠檬香气。AQ 中柠檬烯、壬醛以及葵醛的贡献值均小于AH，但是桉叶油醇却远远高于AH，呈现草药香气。而罗勒烯和辛醛是XS 柠檬中所独有，且ROAV值＞1 的辛醛、柠檬醛、癸醛贡献值均高于其他样品，即呈现出柑橘类青草香香气，也是香水柠檬香气浓郁的主要原因之一。ROAV值可以客观分析挥发性组分对整体风味的贡献，但是无法对样本间的整体香气进行评价。

表4 不同品种柠檬相对气味活度值的结果分析Table 4 Results of the relative odour activity values of lemon juice of different varieties

续表4

如表5所示，3 个主成分累计方差贡献值达到100%，说明3 个主成分能代表17种品质指标的全部信息，如表6所示，主成分PC1 方差贡献值为48.61%，特征值为8.26，即以固形物、橙皮苷、柠檬烯、壬醛以及芳樟醇为主要影响指标。而PC2 主要以pH 值、罗勒烯以及柠檬醛为主。桉叶油醇则是PC3 的主要影响指标。根据贡献率所示，柠檬营养品质指标主要是可溶性固形物、橙皮苷、pH，挥发性风味成分主要是柠檬烯、壬醛、芳樟醇、罗勒烯以及柠檬醛等指标。

表5 柠檬品质主成分的方差贡献率Table 5 Variance contribution rate of principal components of lemon quality

表6 柠檬品质指标主成分载荷矩阵Table 6 Principal component load matrix of lemon quality index

以4 种柠檬样本的总酸、pH 值、固酸比、固形物以及多酚、维生素C 和8 种柠檬关键风味组分为综合评价指标，进行主成分特征值、贡献率及累计贡献率并计算综合得分对柠檬综合品质进行分析。

根据综合PCA 主成分因子得分计算，算出4 种柠檬主成分得分以及综合得分，如表7所示。根据PC1中的FAC1 得分所示，AH 得分最高（1.32）其次是AQ（0.12），即表明AH 品种中固形物、固酸比、橙皮苷、柠檬烯、壬醛以及芳樟醇优于XS 和HQ，因为AH 与AQ 是同一产地不同样本，故在主成分1 中存在很大的相似性。且综合得分最高，说明各指标较为协调、香气怡人以及功能作用更优于其他品种，即表明安岳柠檬更适合于综合利用，而FAC2得分显示XS 品种最高，说明罗勒烯以及柠檬醛、合金欢烯等具有清香柠檬香气的组分含量高于其他品种，即验证了“香水柠檬”香气浓郁的称号，XS 主要是以香气为主，多用于直接食用或菜肴增香等应用。

表7 不同品种柠檬的主成分因子得分Table 7 Principal component factor scores of four varieties of lemon

3 结论

AH 柠檬中固酸比、总酚等含量均优于其他品种柠檬，AQ 中维生素C 含量最高。GC-MS 数据显示柠檬挥发性组分有63 种，主要为烯类、醛类、醇类、酯类、酮类和酚类，电子鼻结果表明，氮氧化合物、硫化物、有机硫化物对柠檬风味贡献较大。通过相对气味活度值分析，ROAV＞1 的关键风味化合物有8 种，其中芳樟醇、壬醛、柠檬烯、柠檬醛以及癸醛贡献值较高，结合嗅闻结果显示他们是柠檬浓郁和特征香气的重要组分。

利用不同品种柠檬理化特性、关键香气成分进行综合得分评价，结果显示：AH 综合得分最高、其次是XS 柠檬，AH 柠檬主要体现在固酸比、橙皮苷以及香气组分得分较高，说明AH 更加适合综合利用，而XS柠檬在FAC2 香气成分得分较高，说明XS 柠檬更适合于直接食用或菜肴增香等应用。