羊栖菜腥味物质分析及其脱除方法比较

匡婷，方宗穆，张名位，张瑞芬，池建伟，黄菲，贾栩超，董丽红，马勤，邓梅，马永轩，郝娟，赵东*

（1.长江大学生命科学学院，湖北荆州 434000）（2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510000）（3.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350000）

羊栖菜（Sargassum fusiforme）属褐藻门马尾藻科，又名鹿角菜、海大麦，分布于我国浙江、福建、广东等地，是我国特有的经济海藻[1]。羊栖菜营养丰富不仅可以食用，据《神农本草经》和《本草纲目》中记载，还有治疗“本豚气”、“水气浮肿”、“宿食不化”等功效[2,3]。现代研究表明，羊栖菜富含蛋白质、多糖和多酚类等，具有良好的抗肿瘤[4]、抗病毒[5]、抗氧化[6]、调节血糖[7]、抗衰老[8]等生物活性，在功能食品领域有着良好的应用前景。但由于羊栖菜腥味较重，使其尚未被消费者广泛接受。因此，如何脱除羊栖菜的腥味，成为了制约其产业化发展的主要难题之一。现有的众多脱腥方法，可分为物理的、化学的、微生物的、感官掩蔽及复合脱腥方法[9]，例如利用高温使腥味化合物挥发，从而达到脱腥效果[10]；使用醋酸、柠檬酸、苹果酸等浸泡样品，通过有机酸消除样品中的组胺、螯合金属离子等方式减少腥味物质的产生[11]；通过发酵产生优势风味FAAs 和特征风味物质显著增强；通过添加紫苏、香菜、葡萄籽、迷迭香等植物对异味进行掩蔽，且能有效抑制脂质氧化，改善风味；以及通过复配天然植物脱除鱼腥味[12]。对比众多的脱腥方法，采用天然植物对物质进行脱腥处理，不仅成本低廉、食用安全，且降低腥味并赋予食物独特风味，还具有一定抗菌、抗氧化，延长产品贮藏时间，易于工业生产等优点。

因此，本研究尝试利用金银花、柠檬、抹茶和葡萄籽皮等天然植物对羊栖菜进行脱腥处理，并通过HS-SPME-GC-MS 和GC-O 比较分析各组的腥味成分差异，选择一种最佳的羊栖菜脱腥剂，并优化其脱腥工艺，为今后羊栖菜的产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊栖菜来自浙江省洞头岛；金银花购自福建省合盛康生物技术有限公司；柠檬粉购自晋江市焕荣堂贸易有限公司；抹茶粉购自浙江省桐乡市供销电子商务有限公司；鲜葡萄为辽宁省营口市巨峰葡萄。

抗坏血酸购自天津市百世化工有限公司；C5-C25正构烷烃混标，上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠（AR），天津市大茂化学试剂厂；4-辛醇标准品（纯度＞99.0%），东京化成工业株式会社。

1.2 仪器与设备

固相微萃取手动进样手柄与 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，美国 Supelco 公司；7890B/5977BMSD 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；6890B/5977BMSD 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；嗅闻仪ODP3，德国Gerstel 公司；20 mm钳口的20 mL 透明顶空样品瓶，上海安谱科学仪器有限公司；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；振动式细胞级超微粉碎机XDW-6B，济南达微机械有限公司。

1.3 天然植物对羊栖菜除腥方法

1.3.1 样品处理

1.3.1.1 羊栖菜预处理

将新鲜羊栖菜清洗，浸泡12 h，沥干后作为除腥研究的原料。沥干羊栖菜置于50～60 ℃热风干燥烘箱干燥24 h，并用振动式细胞级超微粉碎机粉碎。

1.3.1.2 金银花预处理

将干制金银花置于50 g 手提式高速粉碎机中粉碎，过60 目筛网，备用。

1.3.1.3 葡萄预处理

将葡萄皮和籽洗净，沥干，置于55 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘24 h，中间翻拌2～3 次。干燥后的样品置于50 g 手提式高速粉碎机中粉碎备用。

1.3.2 天然植物对羊栖菜除腥的挥发性风味物质测定（HS-SPME-GC-MS）

1.3.2.1 不同植物对羊栖菜除腥挥发性风味物质顶空固相微萃取

往500 mL烧杯中加入50 g羊栖菜粉，再分别加入3wt%抹茶粉、3wt%葡萄籽皮粉、3wt%柠檬粉和3wt%金银花粉，以不加植物粉组为对照，料液比1:50，85 ℃水浴2 h。将样品4 ℃，4 000 r/min，离心5 min，取上清，抽滤后转移到20 mL 顶空样品瓶，放入磁力搅拌子后钳紧瓶盖。将顶空瓶立即置于55 ℃恒温磁力搅拌器中平衡20 min，插入已老化的SPME 纤维头，顶空萃取45 min；萃取结束后，立即将SPME纤维头插入GC-MS 进样。

1.3.2.2 气相色谱质谱分析条件

GC 条件：HP-5MS 型（30 m×250 μm×0.25 μm）毛细管柱；载气为高纯氦气（99.999%）；恒流恒压模式，流量为1.66 mL/min，压力为91.70 kPa，不分流模式；进样口温度250 ℃；柱温初始温度40 ℃，以4℃/min 升至240 ℃，保持2 min，总运行时间约为 52 min。MS 条件为电子轰击离子源（EI），电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，四极杆温度150 ℃；扫描质量范围35～400m/z。

1.3.2.3 挥发性物质定性分析

利用气相色谱质谱联用仪（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）工作站的自动解卷积系统（Auto Mass Spectral Deconvolution & Identification System，AMDIS）与NIST14 质谱库结合化合物保留指数值（Retention Index，RI）对挥发性风味物质进行鉴定。将C5-C25正构烷烃混标在与样品相同的色谱、质谱条件下进样，记录保留时间，根据程序升温保留指数公式（1）计算各挥发性风味物质的RI[13]：

式中：

Tm——样品中某一挥发性风味物质的保留时间；

Tn+1——碳原子数为n+1 的正构烷烃的保留时间；

Tn——碳原子数为n 的正构烷烃的保留时间；n

1.3.2.4 挥发性物质定量分析

将样品中加入浓度为1.37 μg/mL 的4-辛醇标准品溶液200 μL，样品中各个挥发性风味物质的含量，按公式（2）计算：

式中：

B——挥发性风味物质的含量，μg/kg；

S1——待测挥发性风味物质的峰面积；

S2——内标物的峰面积；

m1——样品干基重，g；

m2——内标物的质量，μg。

1.3.3 GC-O 分析

1.3.3.1 GC-O 分析条件

采用7890 型GC 仪配ODP-3 嗅觉检测器进行嗅闻分析。提取的挥发性风味物质进GC 后，按3:1 的比例分别进入嗅闻仪和质谱检测器，色谱条件同1.3.2.2，GC-O 嗅闻加热温度为180 ℃。

1.3.3.2 GC-O 气味强度分析

由4 名年龄介于20～26 岁有嗅闻经验的女性人员组成感官评定小组，在试验过程中描述并记录挥发性风味物质的出峰时间、气味特征及气味强度（Odor Intensity Value，OIV）。参考文献方法[14]将气味强度分四个等级，“1”表示可以准确识别气味但持续时间短，“2”表示能快速识别气味且持续时间长，“3”表示能准确快速识别气味且持续时间较长，“4”表示能准确快速识别气味且持续时间更长[15]。感官评定小组的所有成员对每个样品进行嗅闻，最终每个挥发性风味物质的香气强度值以总强度的平均值取整数后计。

1.4 金银花除腥法

1.4.1 单因素实验

分别以金银花粉添加量，加热时间，加热温度进行单因素试验。

（1）金银花粉末添加量对羊栖菜除腥效果的影响：分别往50 g 羊栖菜粉中加入0wt%、2wt%、4wt%的金银花粉末，料液比1:40，55 ℃水浴120 min。

（2）加热时间对羊栖菜除腥效果的影响：分别往50 g 羊栖菜粉中加入2wt%金银花粉末，料液比1:40，55 ℃水浴60、120、180 min。

（3）加热温度对羊栖菜除腥效果的影响：分别往50 g 羊栖菜粉中加入2wt%金银花粉末，料液比1:40，25 ℃、55 ℃、95 ℃水浴120 min。

收集各组处理样品，4 ℃，4 000 r/min 离心5 min，取上清。按照 1.3.2.1 和 1.3.2.2 进行HS-SPME-GC-MS 定量分析。

1.4.2 ROAV 法对挥发性风味物质的分析

香气成分对食品香气体系的贡献不仅仅取决于其浓度，更是与其自身阈值密切相关，因此需要定量和分析食品中挥发性香气成分的贡献度，Acree 等[16]提出香气活力值（Odor Activity Value，OAV）的概念，指香气成分在香气体系中的绝对或质量浓度（C）与其香气或感觉阈值（T）的比值，即：

将样品总体风味贡献最大的组分即相对气味活度值（OAV0）定义为100，则其他成分（A）可表示为：

所有组分ROAV≤100，且ROAV值越大，对样品总体风味贡献越大。

1.5 统计分析

所有样品均设置3 个重复，含量数据用均值±标准差表示。采用SPSS 26 对数据进行显著性分析，不同英文字母表示差异显著（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 天然植物对羊栖菜除腥的挥发性风味物质的分析

采用7890B/5977BMSD 气-质谱联用色谱仪测定不同植物对羊栖菜腥味物质的影响，结果如图1所示不同植物处理后的成分含量和种类均有变化，且各挥发性风味物质的种类及含量如图2所示。羊栖菜原样中检测出24 种挥发性风味物质，金银花除腥样中检测出19 种，抹茶除腥样检测出22 种，柠檬除腥样检测出23 种，葡萄籽皮除腥样检测出22 种，均为醛类、醇类、酮类、烃类和杂环类，羊栖菜原样中各类挥发性物质的含量分别为20.8%、20.8%、16.67%、33.30%和8.30%，可初步断定中醛类、酮类和醇类对羊栖菜腥味贡献最大，因为烃类组分味道较轻或芳香阈值较高，对风味的贡献不大[17,18]。

图1 天然植物处理羊栖菜挥发性成分的总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of Sargassum fusiforme treated by natural antioxidant plants

图2 天然植物对羊栖菜除腥各风味物质相对含量的影响Fig.2 Effect of natural antioxidant plants on the relative content of various flavor substances in deodorization of Sargassum fusiforme

对比羊栖菜原样，金银花除腥样中醛类、醇类、酮类、烃类和杂环类含量分别为8.70%、6.52%、6.52%、17.39%、2.17%；抹茶除腥样中分别为15.22%、4.35%、13.04%、13.04%、2.17%；柠檬除腥样中分别为 15.22%、10.87%、2.17%、17.39%和4.35%；葡萄籽皮除腥样中分别为17.39%、10.87%、4.35%、10.87%和4.35%，四种植物均在不同程度上降低了羊栖菜原样中醛类、醇类、酮类、烃类和杂环类挥发性成分，其中金银花降低羰基化合物及醇类物质效果较好。基于已报到的文献，大部分海产品中多不饱和脂肪酸经代谢而衍生出的挥发性羰基和醇类化合物，这些衍生物对其气味有很大贡献[11,19]，所以金银花可能是较为理想的除腥剂。

2.2 天然植物对羊栖菜除腥的挥发性风味物质GC-O 分析

2.2.1 天然植物对羊栖菜除腥的挥发性风味物质GC-O 气味强度分析

羊栖菜组、金银花组、抹茶组、柠檬组和葡萄籽皮组中挥发性风味物质、气味描述及其强度分别见表1、表2、表3、表4和表5，共检测到46 种气味活性化合物（OIV≥1）。羊栖菜原样中24 种挥发性物质，其中5 种醛类、5 种醇类、4 种酮类、8 种烃类和2 种杂环类，OIV≥3 的强气味活性化合物有庚醛、壬醛、β-紫罗兰酮、(E)-β-紫罗兰酮和1-辛醇。据文献报道，庚醛、壬醛和紫罗兰酮等挥发性物质通常呈现出一些令人不悦的腐臭味，是鱼肉腥味的来源[19-21]。所以我们推断上述5 种物质所呈现的气味可能是羊栖菜中腥味的主要来源。

表1 羊栖菜原样中挥发性风味物质气味描述及强度Table 1 The odor description and intensity of volatile flavor compounds in Sargassum fusiforme

表2 金银花除腥样中挥发性风味物质气味描述及强度Table 2 The odor description and intensity of volatile flavor compounds in Honeysuckle deodorization

表3 抹茶除腥样中挥发性风味物质气味描述及强度Table 3 The odor description and intensity of volatile flavor compounds in matcha tea deodorization

表4 柠檬除腥样中挥发性风味物质气味描述及强度Table 4 The odor description and intensity of volatile flavor compounds in lemon deodorization

表5 葡萄籽皮除腥样中挥发性风味物质气味描述及强度Table 5 The odor description and intensity of volatile flavor compounds in grape seed peel deodorization

金银花组中检测到的19 种气味化合物，其中含有4 种醛类、3 种醇类、3 种酮类、8 种烃类和1 种杂环类，OIV≥3 的强气味活性化合物有辛醛、β-紫罗兰酮和(E)-β-紫罗兰酮。据文献报道，辛醛呈现出柑橘的清新芳香[22,23]，所以辛醛可能是金银花组中主要的香气贡献者，并且与紫罗兰酮共同呈现出强烈的紫罗兰花香，这可能归因于不同挥发性化合物的种类和浓度共同作用而表现出不同的气味。也有文献表明，相当多的化合物被总结为具有不同于或部分不同于参考描述的气味。因为气味描述也会受到基质效应，以及遗传和文化差异导致的人类评估者能力的差异的影响[24]。

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抹茶除腥样中检测到的22 种气味化合物，其中含有7 种醛类、2 种醇类、6 种酮类、6 种烃类和1 种杂环类，并且OIV≥3 的强气味活性化合物只有(E)-β-紫罗兰酮，微弱的呈现出海藻腥味。

柠檬除腥样中检测到的23 种气味化合物，其中含有7 种醛类、5 种醇类、8 种酮类、1 种烃类和2 种杂环类，OIV≥3 的强气味活性化合物有(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-酮、芳樟醇、壬醛、月桂烯和γ-松油烯。据研究报道，(E)-2-壬烯醛表现出黄瓜清香，1-辛烯-3-酮表现出蘑菇味[21]，芳樟醇则呈现出清香味[25,26]，所以柠檬脱腥样品主要呈现出清香、花香和哈喇味。

葡萄籽皮除腥样中检测到的22 种气味化合物，其中含有8 种醛类、5 种醇类、8 种酮类、8 种烃类和2种杂环类，OIV≥3的强气味活性化合物只有呈现出哈喇味的γ-松油烯[27]。

2.2.2 不同植物对羊栖菜除腥风味轮廓分析

不同植物对羊栖菜风味特征的改变，主要包括清香味、花香味、甜香味、海腥味、哈喇味和塑料味，所以本研究通过评价各类风味特征的挥发性风味物质的总气味强度，得到四种天然植物对羊栖菜的脱腥风味轮廓图。如图3所示，羊栖菜原样主要呈现出海腥味，分别加入金银花、抹茶、柠檬和葡萄籽皮后，在一定程度上降低了羊栖菜的腥味，也激发出其它风味：其中金银花除腥样，通过花香味掩盖了了羊栖菜的海腥味；抹茶虽降低了羊栖菜的海腥味，但同时也降低了样品的清香、甜香、花香味；柠檬和葡萄籽皮在降低海腥味的同时，加重了哈喇味，这可能是由于羊栖菜中脂质氧化，产生了烃类、醛酮等物质[28]。最后，综合比较四种羊栖菜脱腥材料，金银花是较为适合用于羊栖菜脱腥。

图3 不同植物对羊栖菜除腥各风味物质的风味轮廓图Fig.3 The flavor profile of deodorization of Sargassum fusiforme by different antioxidant plants

2.3 金银花添加量对羊栖菜除腥效果的影响

采用6890B/5977BMSD气-质联用色谱仪测定金银花添加量对羊栖菜除腥的挥发性风味物质，并通过结合风味化合物含量、香味阈值及ROAV，分析不同金银花添加量对羊栖菜除腥效果，进而探究金银花的脱腥工艺[29]。将样品整体风味贡献最大组分的ROAV定义为100，用ROAV量化评价不同挥发性物质对总体风味的贡献程度，即ROAV≥1 的组分为样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的组分对样品总体风味化合物起重要修饰作用[30,31]。如表6所示，在羊栖菜原样中，醛类物质阈值较低且含量占比高，对风味贡献较大，其中(E)-2-癸烯醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、(E)-2,4-癸二烯醛、葵醛和(E)-2-壬醛，这些挥发性物质可能是羊栖菜腥味的主要来源[21,32-35]。结果表明，添加金银花能够显著降低羊栖菜原样的腥味成分，其中包括降低了(E)-2-辛烯醛、壬醛、(E)-2-癸烯醛、癸醛和(E)-2,4-癸二烯醛的ROAV，且金银花添加量为4%的ROAV更低，所以金银花添加量是影响羊栖菜腥味的主要因素之一，且4%添加量更优。

表6 不同金银花添加量对羊栖菜除腥中挥发性风味物质含量Table 6 Effects of different amounts of honeysuckle on the content of volatile flavor substances in deodorization of Sargassum fusiforme

2.4 加热温度对羊栖菜除腥效果的影响

采用6890B/5977BMSD气-质联用色谱仪测定加热温度对羊栖菜除腥的挥发性风味物质，并通过结合风味化合物含量、香味阈值及ROAV，分析不同温度对羊栖菜除腥效果的影响，以确定适合的脱腥温度。研究结果表明加热可促使腥味物质的释放，如表7所示，羊栖菜原样中风味贡献最大的化合物(E)-2-癸烯醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、(E)-2-壬醛、(E)-2,4-癸二烯醛和葵醛。结果表明，不同温度（55 ℃和95 ℃）均在一定程度上降低羊栖菜腥味物质的ROAV，减弱羊栖菜的腥味。其中55 ℃处理组降低了(E)-2-壬醛、(E)-2-癸烯醛、癸醛和(E)-2-辛烯醛的产生；而95 ℃水浴加热虽然降低了(E)-2-壬醛、(E)-2-癸烯醛和(E)-2-辛烯醛的产生，但大幅增加了壬醛和葵醛的产生，使羊栖菜带有脂味，呈现出明显的哈喇味[35,36]。因此，温度显著影响羊栖菜腥味物质的产生，且高温不适合羊栖菜脱腥，同样的结果也在谢林明等研究中[37]在60 ℃条件下加热30 min，螺旋藻溶液的腥味已很淡。而在加热温度大于60 ℃时，叶绿素受热后变为脱镁叶绿素，发生变色，并出现螺旋藻蛋白沉淀，因此加热脱腥的温度最好不超过60 ℃。徐玉雪等[38]通过研究发现在30 ℃～90 ℃范围内，随着红毛藻处理温度升高，其腥味感官评分逐渐降低，且在90 ℃达到最低值。王琳等[39]研究发现加热温度对螺旋藻脱腥效果影响较大，随着温度的增加，螺旋藻的腥味越来越淡。故选择加热55 ℃作为羊栖菜除腥的加热温度。

表7 加热温度对羊栖菜除腥中挥发性风味物质含量Table 7 Effects of heating temperature on the content of volatile flavor substances in deodorization of Sargassum fusiforme

2.5 加热时间对羊栖菜除腥效果的影响

采用6890B/5977BMSD气-质联用色谱仪测定加热时间对羊栖菜除腥的挥发性风味物质，通过结合风味化合物含量、香味阈值、及ROAV，分析不同加热时间对羊栖菜除腥效果的影响，以确定最佳的加热除腥时间。如表8所示，热处理时间显著羊栖菜风味物质壬醛和癸醛的浓度，其中加热60 min 和180 min 均降低了这三种风味化合物的产生，减弱了羊栖菜的腥味，并且60 min 效果更好，但加热120 min 增加了壬醛和癸醛的产生，使得羊栖菜呈现出带有脂氧化的哈喇味[35,36]，所以热处理时间是羊栖菜脱腥工艺的重要因素之一。与本研究不同是阳晖等[40]发现加热时间对螺旋藻的脱腥效果影响较小。这可能是由于两种材料的腥味组成和产生机制有所不同。基于本研究结果，综合考虑脱腥效果与效率，选择60 min 作为羊栖菜除腥的加热时间。

表8 加热时间对羊栖菜除腥中挥发性风味物质含量Table 8 Effects of heating time on the content of volatile flavor substances in deodorization of Sargassum fusiforme

3 结论

本实验通过采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（SPME-GC-MS）和GC-O 分析等方法分析了羊栖菜腥味来源，并探究金银花、抹茶、柠檬和葡萄皮等天然植物在羊栖菜脱腥过程中挥发性物质的变化，从而确定最适合羊栖菜腥味脱除的材料。实验结果表明，羊栖菜含有24 种挥发性风味物质，包括5 种醛类、5 种醇类、4 种酮类、8 种烃类和2 种杂环类。其中庚醛、壬醛、β-紫罗兰酮、(E)-β-紫罗兰酮和1-辛醇是羊栖菜腥味的主要来源，呈现出海腥味和哈喇味。另外，添加不同植物对羊栖菜进行脱腥处理，在一定程度上均降低或掩盖了了羊栖菜中的腥味，其中金银花粉除腥效果最好，不仅降低了羊栖菜中腥味及哈喇味，还增加了令人愉悦的花香。为了进一步优化金银花对羊栖菜的脱腥效果，我们探究了金银花粉添加量、加热时间、加热温度对羊栖菜脱腥效果的影响。通过单因素实验设计，结合ROAV法进行分析，研究结果表明金银花的不同添加量、处理温度和时间均能降低羊栖菜风味贡献最大的挥发性物质的ROAV，其中包括四种腥味挥发性物质（(E)-2-癸烯醛、(E)-2-辛烯醛、壬醛、(E)-2-壬醛），以及两种芳香挥发性物质（(E)-2,4-癸二烯醛和癸醛）。本研究确定了羊栖菜除腥的最佳工艺：金银花添加量为4%，加热温度为55℃，加热时间为60 min。