细菌纤维素-甲壳素-玉米醇溶蛋白颗粒复合膜的制备与表征

高若航，李青，万芝力，杨晓泉

（华南理工大学食品科学与工程学院植物蛋白与胶体研究中心，广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东广州 510640）

废弃塑料膜造成了严重的土地污染、海洋污染和水源污染，甚至威胁到动物与人类的生存[1]。自2020年限塑令发布以来，淀粉[2]、纤维素[3]、聚乳酸[4]等可降解聚合物逐步取代合成类聚合物，成为膜材料制备的热门原料。细菌纤维素（Bacterial Cellulose，BC）是一类由木醋杆菌等微生物发酵合成的一种天然纳米纤维聚合物，其化学结构与植物纤维素相同；凝胶状的BC 由许多有序排列，紧密结合的高长径比纳米纤维组成，其干燥后形成的膜材料具有优异的机械性能[5]。纯BC 膜功能单一难以作为功能材料发挥作用，同时其亲水性过强的特点极大的限制了其在食品邻域（如吸管材料）中的应用。目前，为了改善BC 膜过于亲水的特点以及拓展其应用，常用的解决方式是将BC 与其他物质（如纤维素、蛋白质）进行复合制备性能更为优良的复合膜材料[6,7]。

甲壳素（Chitin）是含量仅次于纤维素的第二大生物聚合物，也是自然界唯一的聚阳离子多糖，主要存在于虾、蟹、真菌等生物体中，组成甲壳素的分子链排列有序，存在分子内和分子间氢键，因而具有较高的强度和模量。此外，作为生物来源的天然聚合物，甲壳素也具有良好的生物相容性和生物可降解性，是一种绿色环保的原料[8]。目前，已有相关学者将甲壳素通过机械处理制备出纳米纤维（Chitin Nanofibrils，CH），并将其应用在BC 膜的制备中。例如，Yang 等[7]将CH 在BC 原位合成阶段加入，经纯化干燥后可得到纳米填充膜；该原位合成的改性BC 基材料具有一定的抗微生物效应。但该方式生产周期长，产品品质对生长环境要求较高。因此，有必要探索更快速有效的工艺来制备更多功能特性的BC-CH 复合膜。玉米醇溶蛋白（Zein）为一种醇溶蛋白，通过反溶剂技术可制备出纳米颗粒。玉米醇溶蛋白颗粒（Zein Nanoparticles，ZN）可应用在荷载疏水活性物质的多功能性材料中，且已有研究证明将其添加到纤维膜中的可行性[9]。

然而，目前鲜有关于快速制备纯天然原料基功能性复合膜的研究。抄纸技术作为一项成熟的造纸工艺，具有操作简单、耗时短等优点，且制备的纤维素膜分布均匀、表面光滑，利于工业化大规模生产[9]。基于前期研究结果[9]，本实验以BC、CH 和ZN 为原料，利用快速抄纸工艺先通过抽滤除去成膜溶液中的大部分水分，后将湿膜基质经热压干燥制得BC-CH-ZN 复合膜。重点研究BC 和CH 组成比例和ZN 的加入对BC 膜微观结构、机械性能和表面接触角的影响。同时进一步在ZN 中加入天然抗菌剂百里香酚（Thymol，TH），考察TH 添加对BC-CH-ZN 复合膜机械性能的影响。最后，研究复合膜的热稳定性、元素分析和抗菌性能。本研究可为开发具有更多功能特性的BC 复合膜提供指导意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

细菌纤维素，海南椰国食品有限公司；甲壳素（CTI），山东奥康生物科技有限公司；玉米醇溶蛋白Zein，美国Sigma 公司；冰醋酸（分析纯），广东光华科技股份有限公司

RK3AKWT 型凯塞法自动抄纸系统，奥地利PTI公司；INSTRON 5943 型拉伸压缩材料试验机，美国Instron 公司；OCA20 型视频光学接触角测定仪，德国Dataphysics 公司；BSA224S 型分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DF-1 型磁力搅拌器，江苏金坛市环宇科学仪器厂；ZEISS Merlin 型高分辨率热场发射扫描电镜，德国Zeiss 公司；L&W 250 型厚度仪，瑞典Lorentzen&Wettre 公司；M-110EH-30 型高压微射流纳米均质机，美国MFIC 公司；JY98-IIID 型超声破碎仪，新芝生物科技有限公司；RV10 digital 型旋转蒸发仪，德国IKA 公司；TG209F1 型TGA 热重分析仪，德国耐驰公司；VERTEX 70 型傅里叶变换红外光谱仪，德国Bruker 公司；Vario EL cube 型元素分析仪，德国Elementar 公司。标明具体公司

1.2 实验方法

1.2.1 细菌纤维素（BC）悬浮液的制备

1.2.1.1 纯化

用纯水冲去BC 表面残留的培养基、菌体及杂质后将其置于0.2 mol/L 的NaOH 溶液中，于90 ℃下蒸煮30 min。蒸煮后取出用纯水重复冲洗多次，直至获得中性BC 分散液。

1.2.1.2 机械处理

将纯化后的BC 与纯水按质量比1:1 混合，使用均质机高速（12 000 r/min）剪切10 min，随后将其置于胶体磨中剪切30 min 进一步细化纤维，最后通过高压微射流（137.9 MPa）处理10 次，获得BC 纳米纤维悬浮液。

1.2.2 甲壳素纳米纤维（CH）悬浮液的制备

参考Ifuku 等[10]的制备方法。称取1 g CH 粉末分散在99 g 纯水中，用冰醋酸调pH 值至3.0，搅拌10 min后置于均质机（10 000 r/min）剪切5 min，再用高压微射流（137.9 MPa）处理10 次，获得CH 悬浮液。

1.2.3 玉米醇溶蛋白纳米颗粒（ZN）的制备

参考Patel 等[11]的制备方法。将1 g Zein 溶解在40 mL 80%（V/V）的乙醇溶液中，搅拌确保样品充分溶解。在1 000 r/min 搅拌状态下，将100 mL 纯水快速倒入zein 醇溶液中，继续搅拌15 min 后将溶液置于旋转蒸发仪中（40 ℃，100 r/min），除去乙醇和少量水分，获得1 wt%的ZN 分散液。

1.2.4 荷载百里香酚（TH）的ZN 制备

参考Li 等[12]的制备方法。称取1 g Zein 粉末，溶解在40 mL 80%（V/V）的乙醇溶液中，搅拌至充分溶解。随后，将一定质量的TH 粉末加入Zein 醇溶液中，TH 质量分数为蛋白量的10%～40%。最后，采用反溶剂过程（同1.2.3）制得含有不同质量分数TH 的ZN 分散液（ZN 浓度固定为1 wt%）。

1.2.5 复合膜的制备

1.2.5.1 细菌纤维素-甲壳素纳米纤维（BC-CH）复合膜的制备

将0.1wt% BC和0.1wt% CH悬浮液按质量比10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、0:10 混合，得到总质量为120 g的混合液；之后，将该混合液搅拌1 h 后置于超声破碎仪中处理10 min，功率为100 W，输出频率为50%。将超声后的混合液脱气后进行抽滤处理得到湿膜。最后将其置于凯塞法半自动抄纸系统中（90 ℃，0.1 MPa）干燥10 min，得到复合膜。

1.2.5.2 细菌纤维素-甲壳素纳米纤维-蛋白颗粒（BC-CH-ZN）复合膜的制备

将含有不同浓度的TH（ZN 质量分数0～40%）的ZN 颗粒（1wt%）和BC-CH 混合液（0.2wt%，质量比为5:5）混合，得到的悬浮液总质量为120 g，混合纤维浓度为0.1wt%，ZN 浓度为0.01wt%～0.05wt%（纤维质量分数10%～50%）。按1.2.5.1 所述方法制得含有10%～50% ZN（相对总纤维质量）的复合膜。

1.2.6 纳米纤维微观结构表征

采用原子力显微镜观察纳米纤维的微观结构。将纤维素液稀释至0.01wt%，在100 W 下超声10 min 使悬浮液分散均匀，取2 μL 悬浮液滴在新剥离的云母片上，通风橱下室温干燥后，用轻敲模式观察纳米纤维结构（扫描范围为5 μm×5 μm）。

1.2.7 膜厚度测定

用分辨率为0.1 μm 的L&W 厚度仪测定膜厚度。随机选取膜十个位置，测定其厚度值，计算得到膜厚度的平均值。

1.2.8 膜表面微观结构表征

采用扫描电子显微镜观察膜表面的微观结构。将复合膜粘在样品盘上，喷金10 min 后将其放入电压为5 kV 的扫描电镜观察室中观察。

1.2.9 膜物理特性表征

1.2.9.1 机械性能测定

参照GB/T 1040.3-2006《塑料拉伸性能测定》中对薄膜机械性能的测定方法[13]，用拉伸压缩材料试验机测试复合膜的机械性能，将平衡48 h 后的复合膜裁成40 mm×5 mm 的矩形条，将初始距离设置为10 mm，拉伸速度设置为0.5 mm/s。每个样品测十个平行，取平均值。其中抗拉强度（TS）为膜断裂时承受的最大载荷与膜横截面的比值，断裂伸长率（EAB）为膜断裂长度与初始长度之差占初始长度的比值。

1.2.9.2 接触角测定

采用座滴法测量复合膜表面的水接触角，设定液滴量为5 μL，分别测定液滴刚接触膜表面及接触10 s后的膜接触角。每个膜样测六次平行，去除最大值和最小值后计算得到平均值。

1.2.9.3 红外光谱

用FT-IR 仪全反射组件测定膜材料吸收光谱，扫描范围为400～4 000 cm-1。

1.2.9.4 元素分析

准确称取4.5 mg 剪碎后的复合膜于元素分析仪中测定其C、H、N 元素的含量。

1.2.9.5 热稳定性

用热重分析（TG）技术观测程序控温下物质质量与温度或时间的变化关系，载气N2，温度范围30～600℃，升温速度20 ℃/min。

1.2.9.6 抗菌活性测定

根据GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数的测定》中的方法对菌浓度进行确定[14]，参考Zhao等[15]的实验方法，取稀释至105CFU/mL 的大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）菌悬液3 mL 加至10 mL 试管中，称取裁剪后的经紫外灭菌1 h 的纯BC 膜、BC 和CH 质量比为5:5 的BC-CH复合膜、BC-CH-10% ZN 复合膜、BC-CH-30% ZN 复合膜、BC-CH-40% ZN 复合膜、BC-CH-50% ZN 复合膜各50 mg 于菌悬液中，于200 r/min、37 ℃摇床培养，分别通过测12 h 后的OD600值及观察菌落得出细菌生长曲线和细菌生长抑制情况。

1.2.10 数据统计分析

用SPSS 17.0 和Origin 2018 对数据进行统计分析，所得数据均为不少于3 次重复的均值，以“平均值±标准偏差”表示，采用方差分析（ANOVA）不同平均值之间的差异显著性，p＜0.05 表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 细菌纤维素（BC）和甲壳素纳米纤维（CH）的微观结构

纳米纤维的尺寸直接影响纤维间结合的紧密程度和复合纤维膜的厚薄程度及机械强度等；过细的纤维尺寸要求有更高的机械处理强度，而过粗的纤维尺寸会影响纤维膜的孔隙度，从而进一步影响其机械性能[3]。因此，首先使用AFM 对BC 和CH 的微观结构进行观察。如图1所示，通过胶体磨和高压微射流处理过的BC 和CH 的形态均一，纤维之间紧密堆积，能形成纤维网络结构，为复合膜的制备提供了可能。与BC 相比，CH 具有更小的纤维尺度和宽度，两者直径均处于5～50 nm 之间，这分别与王丽英[9]和Hai[16]等用机械法拆解得到的纤维形态类似。

图1 BC（a）和CH（b）的原子力显微镜图Fig.1 2D AFM images of BC (a) and CH (b) nanofibrils

2.2 BC-CH 纤维组成比例对复合膜的影响

2.2.1 纤维组成比例对复合膜外观、微观结构和厚度的影响

通过快速抄纸过程，成功制备了不同质量比（BC:CH）的BC-CH 复合膜。由图2外观图可看出，单独BC 膜外观完整，证明BC 本身具有良好抄纸成膜的能力。然而，纯CH 膜在热压后出现开裂现象，表明其成膜能力较弱。使用BC 和CH 制备的复合膜表面较为光滑，颜色均匀，形状基本完整。

图2 不同质量比下BC-CH 复合膜的外观图Fig.2 Photographs of BC-CH composite membranes with different BC:CH mass ratios

图3a～3c 为BC-CH 膜表面的扫描电镜图。可以看出，纯BC 膜和纯CH 膜均显示出光滑的表面。在复合膜中，可以看到略细的CH 纤维均匀地分布在BC 纤维之间，且复合膜表面的孔隙度较纯BC 膜有所减少。由复合膜的厚度图（图3d）也可知，复合膜厚度较为均一。同一热压条件下，复合膜厚度随纤维质量比的减小从30.36 μm下降至26.34 μm，其归因于CH较低的尺度。

图3 不同质量比下BC-CH 复合膜表面的扫描电镜图Fig.3 FE-SEM images of BC-CH composite membranes with different BC/CH mass ratios

2.2.2 纤维组成比例对复合膜接触角的影响

图4为不同纤维比例复合膜的接触角变化图，纯BC 膜的接触角（0 s）为32.70°，表明其较强的亲水性。单独CH 膜的接触角可达64.70°（0 s），说明CH 本身的亲水性弱于BC。CH 的加入使复合膜表面形态发生变化因而影响了其表面粗糙度，复合膜的接触角随着CH 占总纤维质量比的增加而增加，故复合CH 后可以改善纯BC 膜亲水性过强的弱点。这也与Shams 等[17]通过测量甲壳素复合膜（55°）和纤维素复合膜（34°）的接触角得出甲壳素复合膜比纤维素复合膜更疏水的结论一致。

图4 不同质量比下BC-CH 复合膜的0 s 和10 s 接触角数据及对应外观图Fig.4 Contact angle (0 and 10 s) values and corresponding images of BC-CH composite membranes with different mass ratios

2.2.3 纤维组成比例对复合膜机械性能的影响

由图5可看出，纯BC 膜的拉伸强度为183.45 MPa，随着纤维质量比（BC:CH）的减少（不低于5:5），复合膜的抗拉强度和断裂伸长率变化不显著（p＞0.05），即当BC 含量大于CH 含量时，在改善纤维素复合膜过于亲水的同时基本不影响复合膜的机械性能。然而，当纤维质量比（BC:CH）低于5:5 时，复合膜的机械强度显著减弱（p＜0.05）；这是由于此时复合膜中CH 含量多于BC，复合膜内部纤维网络较大部分由CH 堆积而成，而CH 网络本身的抗拉伸能力较弱，从而弱化复合膜的机械性能。Wang 等[18]使用甘蔗渣和针叶木浆复合木质素制备的纳米微米复合吸管材料的抗拉强度约70 MPa，明显低于本研究中BC-CH 复合膜的抗拉强度，表明本研究的复合膜具有较好的机械性能，可应用在食品领域（如吸管材料）中。

图5 不同质量比下BC-CH 复合膜的的机械性能Fig.5 Mechanical properties of the BC-CH composite membranes with different mass ratios

2.3 Zein 纳米颗粒（ZN）添加量对复合膜特性的影响

2.3.1 ZN 添加量对膜外观、微观结构及厚度的影响

ZN 是由反溶剂法制备的一种纳米颗粒，在功能性活性成分的荷载及释放等方面发挥着重要的作用[19,20]。为了进一步拓展BC-CH 复合膜的应用，使用Zein 作为功能因子的载体来制备功能性BC-CH 复合膜。在对复合膜进行功能性探究之前，首先研究了Zein 纳米颗粒（ZN）的加入对纤维复合膜外观的影响。由图6可看出，加入ZN 后复合膜表面仍颜色均匀，光滑平整。相对于未添加ZN 的复合膜，含有颗粒的复合膜的外观偏黄，归因于原料中含有的少量叶黄素和玉米黄素等呈色的类胡萝卜素。

图6 不同BC-CH-ZN 复合膜外观图Fig.6 Photographs of different BC-CH-ZN composite membranes

为了进一步确认ZN 的存在并探究蛋白颗粒添加对复合膜微观结构的影响，采用场发射扫描电镜观察了复合膜表面的微观形貌。从图7的电镜图可看到，复合膜内部（图7b 和7c）具有较多凸起的球状颗粒，说明ZN能有效地包覆在复合膜内。这些ZN 均匀分布在纤维网络之间，表明其不会影响纤维网络的形成。此外，复合膜厚度的变化也能表明ZN 的存在。Chen 等[21]将纤维素纳米纤维与银纳米颗粒混合制得不同厚度的复合膜。图7d 为添加不同ZN 后复合膜的厚度变化，该图显示了复合膜厚度随着ZN 的增多从28.41 μm 增加到35.60 μm，表明ZN 的加入提高了复合膜的厚度。

图7 不同BC-CH-ZN 复合膜表面的扫描电镜图Fig.7 FE-SEM images of different BC-CH-ZN composite membrane surfaces

2.3.2 ZN 添加量对复合膜机械性能的影响

如图8所示，复合膜的抗拉强度和断裂伸长率随ZN 的加入有一定程度的下降，通过对拉伸数据进行比较可知，在添加少于30%（相对于纤维）的蛋白颗粒时，TS 和EAB 值与不含颗粒的BC-TH 纤维膜的机械性能无显著差异（p＞0.05），分别从171.4 MPa 变化为157.5 MPa，从2.11%变化为2.08%，而进一步增加ZN的添加量则会明显降低复合膜的机械性能。Ahmadizadegan 等[22]研究的以氨基苯甲酸为原料合成的双氢氧化物纳米颗粒对聚酰亚胺膜抗拉强度的影响和Li 等[23]研究的玉米醇溶蛋白纳米颗粒对纤维素膜的机械性能的影响都得出了纳米颗粒先增强后减弱膜基质机械性的结论。这主要是由于过量纳米颗粒的加入使部分颗粒在纤维间隙填充饱和的状态下被迫聚集，这些以简单物理堆积的形式组成的膜机械性能弱于以氢键形式结合的膜，因而呈现削弱复合膜机械性能的效果。

图8 含有不同ZN 含量的BC-CH-ZN 复合膜的机械性能Fig.8 Mechanical properties of BC-CH-ZN composite membranes with different ZN concentrations

2.3.3 ZN 添加量对复合膜接触角的影响

由图9可知，随着ZN 含量的增加，纤维复合膜的接触角（0 s）从49.15°增加至77.28°，这是由于分布在纤维间的蛋白纳米颗粒部分暴露在膜表面，使膜的亲水性降低，因而能进一步改善纤维素复合膜过于亲水的缺陷[24]。

图9 含有不同ZN 含量的BC-CH-ZN 复合膜在0 s 和10 s 的接触角数据及对应外观图Fig.9 Contact angle (0 and 10 s) values and corresponding images of BC-CH-ZN composite membranes with different ZN concentrations

2.4 复合膜的红外光谱

FT-IR 进一步用于表征复合膜的表面化学结构。如图10所示，纯BC 膜的FI-TR 图中出现了-OH 的伸缩振动峰（3 334 cm-1），CH2/CH3 基团的C-H 伸缩振动峰（2 900 cm-1），以及C-O-C 伸缩振动峰（1 018 cm-1）。在纯CH 膜的红外光谱图中，除了观察到-OH、-C-H、-C-C的振动峰，也可观察到N-H伸缩振动峰（3 456 cm-1）。相对纯BC 膜和CH 膜，BC-CH 复合膜的羟基伸缩振动峰向较低的波数移动（3 286 cm-1），说明BC 和CH之间形成了分子间氢键。此外，与BC-CH 膜相比，添加ZN 的复合膜在1 531 cm-1处出现新的吸收峰，这是由蛋白颗粒的酰胺II 键产生[25]，进一步说明zein 颗粒已成功合并入复合膜中。同样，与BC-CH 膜相比，BC-CH-ZN 复合膜的羟基伸缩振动峰往较低的波数移动，说明ZN 与BC、CH 之间也形成了氢键作用。此外，TH 对复合膜的红外光谱没有明显影响，说明其被很好地包裹在蛋白颗粒ZN 中。

图10 不同BC-CH-ZN/TH 复合膜的红外光谱图Fig.10 FT-IR spectra of different BC-CH-ZN-TH composite membranes

2.5 复合膜的热稳定性

材料的热稳定性是评价材料能否稳定发挥功能性质的重要指标，图11a 是复合膜质量随温度升高而变化的曲线，可以看到初始受热阶段由于膜中残留的水分挥发，膜质量略微下降，当温度升高到300 ℃左右，膜质量由于纤维素降解，糖基碳化等开始急剧下降，这与Gao 等[26]关于BC 热重分析结果的趋势一致；继续升温，残留的灰分不再进一步降解因而维持一定的重量。对照纯BC 膜，加入CH 纳米纤维复合的膜降解后最终质量大于其原始质量的20%，蛋白颗粒的添加不影响该结果，而纯BC 膜仅为9.80%。此外，从图11b可以看出，BC 膜的减重率高于含甲壳素纤维的复合膜，因此，甲壳素纤维的加入对复合膜的热稳定性具有一定的促进作用。

图11 不同BC-CH-ZN-TH 复合膜的TGA 曲线和DTG 曲线Fig.11 TGA and the DTG curves of the BC-CH-ZN-TH composite membranes

2.6 复合膜的抗菌性能

由图12可知，相对纯BC 膜而言，BC-CH 复合膜对金黄色葡萄球菌有一定的抑制效果，这归因于CH 本身的抗菌作用[7]。同时，当复合膜中添加了百里香酚（TH）时，OD600值进一步降低，且随着TH 含量的增加而减小，说明TH 能提高复合膜对金黄色葡萄球菌的抑制效果。值得注意的是，所有的膜材料皆对大肠杆菌的抗菌效果不明显。Domenico 等[27]研究证实金黄色葡萄球菌对TH 的敏感性高于大肠杆菌，并推测TH 的抗菌作用是由于细菌质膜脂质组分的扰动导致细胞内物质的泄漏。Mathela 等[28]的研究结果有类似的结论，即金黄色葡萄球菌是实验菌种中对TH 最敏感的微生物，抑菌圈为（25±0.98）mm，MIC 值为62.5l g/mL，而大肠杆菌对TH 的抑菌活性较低。本实验制得的复合膜通过添加荷载TH 抗菌剂的颗粒具有较强的抗菌功能，对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显。

图12 不同BC-CH-ZN-TH复合膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长抑制图（a）及金黄色葡萄球菌经BC（b）和5:5-50% ZN（c）膜处理12 h 后形成的细菌菌落照片Fig.12 Growth inhibition of E.coli and S.aureus after treatment with different BC/CH/ZN/TH composite membranes for 12 h (a),and photographs of bacterial colonies formed by S.aureus treated with BC (b) and 5:5-50% ZN (c) membranes for 12 h

3 结论

本实验以细菌纤维素（BC）、甲壳素纳米纤维（CH）、玉米醇溶蛋白纳米颗粒（ZN）为原料，使用快速抄纸法制备了一种纯天然纤维基功能性复合膜。重点探究了BC 和CH 的质量比以及ZN 添加量的变化对复合膜的微观结构、机械性能、接触角和热稳定性的影响。研究结果表明，BC:CH 纤维质量比的减小会降低BC-CH 复合膜的厚度。当纤维质量比不低于5:5时，复合膜的机械性能无显著变化；但低于5:5 时，复合膜的机械强度显著减弱。CH 的加入可以改善纯BC膜亲水性过强的缺点，也能提升膜的热稳定性。此外，ZN 能均匀的分布在纤维网络中，且ZN 能轻微增加BC-CH-ZN 复合膜的厚度，提高复合膜的表面疏水性。当ZN 添加量少于30%时（相对于总纤维质量），复合膜的TS 和EAB 值无显著变化，但ZN 添加量过高时会导致颗粒聚集，从而明显降低复合膜的机械性能。加入荷载TH 的ZN 可使复合膜对金黄色葡萄球菌有更明显的抑制效果。本研究可为多功能BC 基复合膜的开发提供指导价值。