藏黄连多糖-硒纳米颗粒的制备、结构表征及体外抗炎活性

高飞，李友英，范潇，张衍坤，候冉冉*

（1.青岛农业大学化学与药学院，山东青岛 266109）（2.甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川甘孜 626000）

随着社会的飞速发展，我国已经逐步进入老龄化社会，人口老龄化问题是我国当今亟待解决的关键问题。人体免疫力随年龄增加而呈现降低趋势，因此，老年病就容易趁虚入侵老年人。那么，要解决我国老龄化所带来的问题，首先就是要降低我国老年人老年病的发病率，其中，提高老年人口机体免疫力是最重要的一环。青少年是祖国的未来，青少年时期身体快速发育，当机体免疫力出现问题时，身体容易受到外邪侵染，威胁机体健康，所以，不论是老年或是少年，提高机体免疫力都是预防疾病和保持身体健康的根本。现如今，“治未病”的健康观念越来越被人们了解与接受，而保健食品可调节身体功能，可作为膳食调节剂，增强机体免疫力，维持身体健康[1-3]。

微量元素是动植物体不可缺少的重要成分，硒是这些微量元素中尤为重要的一种，具有调节免疫、抗炎等多种药理活性[4,5]。因此，硒的缺乏会导致机体产生一系列的不良症状，如免疫系统损伤、心血管疾病、甲状腺激素代谢异常甚至增加癌症产生的风险。为满足人体对硒的日常需求，补硒是必要的途径，尤其是对于硒含量水平低的人群和缺硒地区。部分无机硒和有机硒如亚硒酸盐、硒代蛋氨酸等可用于人体硒补充剂，然而，无机硒使用的安全窗口窄，生物转化的天然有机硒制备耗时且产量低，无法满足人民日益对硒的营养需求。近年来，随着纳米技术在医药领域的快速发展，硒纳米颗粒的制备和活性逐渐引起科研工作者的关注。与其他无机硒和有机硒化合物相比，硒纳米颗粒具有更高的抗癌、抗氧化、低毒等效果，但硒纳米颗粒极易聚集沉淀，很难用于临床或作为食品添加剂[6]。作为自然界四大生命活动物质之一的多糖，种类多、来源广。大量研究证实，天然多糖具有调节免疫、抗病毒、抗炎症、抗氧化等生物活性[2,3]。多糖结构复杂，分子内含有大量亲水基团，为了克服硒纳米颗粒不稳定、易聚沉的缺陷，可利用多糖修饰硒纳米颗粒形成稳定的多糖-硒纳米颗粒。由于天然多糖具有无毒性、生物相容性良好、可生物降解等特点，且制备得到的多糖硒纳米颗粒稳定性较好，使得多糖在功能化硒纳米颗粒的制备中的应用越来越广泛[7]。天然多糖-硒纳米颗粒与其他无机硒或硒单质比，具有粒径小、生物活性更高、毒性较低的优点[8]。本研究中所采用的藏黄连，为玄参科植物兔耳草属多年生草本植物圆穗兔耳草Lagotis brachystachysMaxim.和全缘叶兔耳草Lagotis integraW.W.Smith.的根，别名洪连、洪轮、兔耳草等，具有清热解毒、利湿平肝、行血调经之功效。用于发热烦渴、头痛眩晕、月经不调、药食中毒等。本研究从藏黄连中提取分离藏黄连多糖（Coptesteeta Polysaccharide，CTP），绿色还原亚硒酸钠合成藏黄连多糖-硒纳米颗粒（CTP-SeNPs）[9]，探究其结构表征、抗氧化活性和抗炎活性，为研发富硒中药多糖保健食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

藏黄连，购于四川甘孜，经鉴定为藏黄连正品；透析袋，截留分子量8 000～12 000 u，上海源叶生物科技有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼）、ABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、总还原力试剂盒（FRAP），购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM、青链霉素（PS）、地塞米松，购自Sigma；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BC-J80s CO2培养箱、YXQ-LS-30S 立式压力灭菌器，上海博讯有限公司；CKX41 倒置显微镜，Olympus Corporation；LGJ-18 真空冷冻干燥机，北京亚星仪科科技发展有限公司；TDL-4C 差速离心机，上海安亭电子仪器有限公司；MK3 酶标仪，Thermo Multiskan；Mastersizer 3000 粒度仪，Malvern Panalytical；Nicolet iS5 红外光谱仪，Thermo Fisher；SU3800 扫描电子显微镜，Hitachi；ARL3000 X 射线衍射仪，760CRT Thermo Scientific紫外可见光谱仪，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藏黄连多糖的提取分离

取500 g 藏黄连，粉碎，过80 目筛，加15 倍量蒸馏水，浸泡过夜，煎煮2.5 h，重复三次，离心合并滤液。将滤液置于真空旋转蒸发仪中，65 ℃浓缩至500 mL，冷却至室温后，加入2 L 无水乙醇，搅拌后静置于4 ℃冰箱中，过夜。5 000 r/min 离心10 min，收集沉淀，冷冻干燥，收集藏黄连多糖[10]。

1.3.2 Sevage 法除蛋白

Sevage 法除蛋白方法参考文献[11]。配制藏黄连多糖浓度为10 mg/mL 的溶液1 740 mL，加入60 mL Sevage 混合液（V正丁醇:V三氯甲烷=1:4）。搅拌45 min，静置30 min 后分层，保留上层弃去下层，重复8 次。浓缩，冷冻干燥，得去蛋白藏黄连多糖（CTP）。

1.3.3 多糖得率的测定

依据参考文献，采用苯酚-硫酸法测多糖含量，标准曲线方程为：

式中：

x——质量浓度，μg/mL；

y——吸光度。

配制多糖溶液，检测其吸光度，并带入标准曲线方程计算出质量浓度，根据文献公式计算多糖得率[12]：

式中：

B——多糖得率，%；

c——质量浓度，μg/mL；

n——稀释倍数；

V——体积，mL;

m——藏黄连质量，g。

1.3.4 藏黄连多糖-硒纳米颗粒（CTP-SeNPs）的制备

1.3.4.1 藏黄连多糖浓度的筛选

分别将0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的CTP 溶液，等体积逐滴加入到20 mL 的50 mmol/L Na2SeO3溶液中，避光搅拌3 h 后，滴加50 mmol/L 的20 mL 抗坏血酸溶液，超纯水补至总体积200 mL，继续避光搅拌12 h。反应结束，将混合液装入截留分子量为8 000～12 000 u 透析袋，4 ℃下避光蒸馏水透析72 h，取透析后的反应液测量粒径，真空冷冻干燥得藏黄连-硒纳米颗粒（CTP-SeNPs），备用。

1.3.4.2 pH 值的测定

蒸馏水配制3 份CTP-SeNPs（10 mg/mL），使用数字pH 计测定样品溶液的pH 值。

1.3.4.3 保水能力和保油能力测定

分别将样品粉末（500 mg）与蒸馏水（5 g）或大豆油（5 g）混合，室温放置1 h，每隔10 min 搅拌一次，12 000 r/min 离心后除去上清液，称量残渣，测定WRC/ORC。按每克干样品的水/大豆油克数计算[13]。

1.3.5 CTP-SeNPs 的结构表征

1.3.5.1 粒径分布

配制浓度为1 mg/mL 的CTP-SeNPs 溶液，使用纳米颗粒度仪检测其粒径分布。

1.3.5.2 红外光谱分析

分别称取2 mg CTP、CTP-SeNPs、SeNPs，将适量研磨均匀、干燥的溴化钾粉末与样品混合，再次研磨均匀后压片，置于红外光谱仪中，在400～4 000 cm-1范围进行扫描[14]。

1.3.5.3 扫描电子显微镜分析（SEM）

分别取2 mg 干燥好的CTP、CTP-SeNPs，喷金后于扫描电镜下分析[14]。

1.3.5.4 X 射线衍射分析（XRD）

将2 mg干燥的CTP-SeNPs置于玻片上，铺匀压紧，放入仪器样品室，检测其元素峰。

1.3.5.5 紫外可见吸收光谱

分别配制1 mg/mL CTP、CTP-SeNPs 和SeNPs 溶液，置于紫外分光光度计中，在200～800 nm 范围内全波长扫描[14]。

1.3.5.6 刚果红测试

2.0 mL 刚果红溶液（0.2 mol/L）、4.0 mL 不同浓度的NaOH 溶液（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）与2 mL CTP（2.0 mg/mL）混合，室温避光搅拌15 min。分别取各混合溶液于紫外分光光度计中，在200～800 nm范围内全波长扫描，记录最大吸收波长，记作λmax。用2.0 mg/mL 的凝胶多糖（Curdlan）替代CTP，作为对照。

1.3.6 CTP 和CTP-SeNPs 体外抗氧化活性

1.3.6.1 DPPH 自由基清除

用无水乙醇配制浓度为0.05 mmol/L DPPH 溶液备用。分别将1 mL不同浓度（0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）的CTP、CTP-SeNPs 和抗坏血酸（Vc）溶液置于试管中，分别加入2 mL DPPH 溶液，使用涡旋仪混匀，置于室温下避光静置30 min，之后测量混合液517 nm 处吸光度，记录吸光度值，记为A样品；测定不同浓度CTP、CTP-SeNPs、Vc 的吸光度，记为A0；取1 mL 蒸馏水于试管中，加入2 mL DPPH 溶液，测定其吸光度，记为A1[15]。DPPH 自由基清除率（B，%）的计算：

1.3.6.2 羟自由基清除

用蒸馏水配制浓度为70 mmol/L 的FeSO4溶液、用无水乙醇配制浓度为70 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、将CTP、CTP-SeNPs 和抗坏血酸（Vc）配制成0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 的六个浓度，向试管中依次加入1 mL FeSO4溶液、1 mL 水杨酸-乙醇溶液、1 mL 样品溶液（CTP、CTP-SeNPs、Vc），最后加入1 mL 体积分数30% H2O2溶液，使用涡旋仪混匀，在室温条件下，静置30 min，测量在510 nm 下吸光度。羟自由基清除能力的计算：

式中：

C——羟自由基清除率，%；

A样品——FeSO4+水杨酸+样品+H2O2；

以华南师范大学继续教育学院为例，由于C语言程序设计课程一般一周4节课，学生参加全国统一考试时间为每年的4月份和10月份。C语言程序设计课程是实践性比较强的课程，要求学生掌握基本的编程语句、语法规则，经过动手编程提升学生的编程逻辑思维能力，为后续的专业课夯实基础，但因实验课时缺乏，造成学生动手编辑能力较差，授课效果不理想。

A0——FeSO4+水杨酸+样品+蒸馏水(1 mL)；

A1——FeSO4+水杨酸+蒸馏水+H2O2。

1.3.6.3 ABTS+自由基清除

用蒸馏水配制浓度为2 mmol/L 的ABTS 溶液和浓度为70 mmol/L 的K2S2O8溶液。取配制的ABTS 溶液与K2S2O8溶液以1:4 的比例混合均匀，在室温避光条件下静置12～16 h，得到ABTS+·溶液，再使用PBS 溶液稀释ABTS+·溶液直至该溶液在Abs=734 nm 处吸光度为（0.70±0.02）。将CTP、CTP-SeNPs 和抗坏血酸（Vc）分别配制成0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 六个浓度。

分别将10 μL 的不同浓度的CTP、CTP-SeNPs 和抗坏血酸（Vc）加入96 孔细胞板中，每个浓度重复三个孔，向每个孔加入200 μL 孵育好的ABTS+·溶液，混匀6 min 后检测各孔在734 nm 处的吸光度（A2）；空白孔加入10 μL 的不同样品溶液和200 μL 的PBS 溶液，混匀6 min 后检测其在734 nm 处的吸光度（A0）；对照孔加入210 μL 的ABTS+·溶液，检测其吸光度（A1）[16]。ABTS+·清除率（D，%）计算：

1.3.6.4 总抗体氧化能力检测（FRAP 法）

1.3.7 CTP 和CTP-SeNPs 体外活性研究

1.3.7.1 CTP 和CTP-SeNPs 细胞增殖活性

5 000个RAW264.7 细胞（100 μL）分别加入96孔板细胞培养板中，置于37 ℃，体积分数5% CO2的细胞培养箱培养12 h 后分别将用PBS 配制的1.0 mg/mL 的CTP 和CTP-SeNPs 倍比稀释后（100 μL）加入至细胞中，置于细胞培养箱中培养24 h，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），继续置于细胞培养箱中培养，4 h 后弃去孔中溶液，每孔加入150 μL DMSO溶液，震荡10 min，酶标仪检测OD570[17]。

1.3.7.2 CTP 和CTP-SeNPs 抗炎活性

5 000个RAW264.7 细胞（100 μL）分别加入96孔细胞培养板中，置于37 ℃，体积分数5% CO2的细胞培养箱中培养12 h，每孔加入100 μL LPS 溶液（0.2 μg/mL），继续置于细胞培养箱中培养12 h 后，分别将用PBS 配制的1.0 mg/mL 的CTP 和CTP-SeNPs倍比稀释后（100 μL）加入到细胞中，培养24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），培养4 h 后弃去孔中溶液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，震荡10 min，酶标仪检测OD570。同样地，药物加入细胞中，培养24 h 后，取上清液，根据ELISA 试剂盒说明书测定上清中的IL-6 的含量。

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 26 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），使用GraphPad 8.0.2 与Origin 2018 进行数据处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 CTP 的制备及理化性质

藏黄连多糖的得率为11.84%，去蛋白藏黄连多糖（CTP）得率为7.72%。CTP 的pH 值为6.42±0.05，保水能力最高值为12.07 g/g，保油能力为11.28 g/g。

2.2 刚果红试验

如图1所示，随着NaOH 浓度的增大，凝胶多糖的λmax也随之增加（红移），凝胶多糖是可知的具有三螺旋结构的多糖，而试验中藏黄连多糖也表现出相同红移情况[18]。因此，推测CTP 可能具有三螺旋构象。

图1 刚果红检测Fig.1 Congo red test

2.3 CTP-SeNPs 的表征

2.3.1 CTP-SeNPs 粒径分布

各浓度藏黄连多糖合成CTP-SeNPs 纳米颗粒，如图2a 所示，当CTP 浓度为1.5 mg/mL 时，CTP-SeNPs的粒径分布相对比较集中且较小，因此，筛选1.5 mg/mL 的CTP 作为最佳浓度。如图2b 所示，结果分析，CTP-SeNPs 的平均粒径为101.96 nm。在前人[5,8,16]的研究中，合成多糖-硒纳米颗粒平均在60 nm～120 nm之间，CTP-SeNPs 的平均粒径与其研究结果大致符合。

图2 藏黄连多糖溶液制备CTP-SeNPsFig.2 Preparation of CTP-SeNPs from Coptesteeta polysaccharide solution

2.3.2 CTP-SeNPs 的紫外可见吸收光谱

如图3显示，CTP-SeNPs 最大吸收峰值出现位置小于200 nm，而SeNPs 在480 nm 处有最大吸收峰值，其位于可见光区，说明SeNPs 呈现橙黄色[19]。有文献报道，当纳米颗粒粒径约200 nm 时在紫外光谱的600 nm 左右有最大吸收峰；当纳米颗粒粒径小于100 nm 左右时，其在红外光谱的最大吸收峰低于300 nm[20,21]。本研究中经DLS 检测CTP-SeNPs 的平均粒径为101.96 nm，这与文献报道相似。研究表明，核酸紫外最大吸收峰出现在260 nm 处[21]，在CTP 和CTP-SeNPs 的全波长扫描图谱中，在260 nm 处均未出现吸收峰，表明CTP 中核酸含量较低。蛋白质紫外最大吸收峰出现在280 nm 处[22]，在CTP 的全波长扫描图谱中，CTP 在280 nm 处未表现出吸收峰，说明CTP 中无蛋白存在，而CTP-SeNPs在280 nm附近出现吸收峰，表明SeNPs 与CTP 相互作用形成复合物CTP-SeNPs。在Wang[14]的研究中显示，与RTFP-3（刺梨多糖）相比，RP3-SeNPs（刺梨多糖硒纳米颗粒）在278 nm 处有吸收峰，推测SeNPs 与RTFP-3 相互作用形成了复合物，该结果与本研究结果相似。

图3 CTP、CTP-SeNPs 和SeNPs 的紫外全波长扫描Fig.3 Full-wavelength UV scanning of CTP,CTP-SeNPs and SeNPs

2.3.3 红外光谱分析

CTP、SeNPs 和CTP-SeNPs 红外光谱见图4。CTP在3 446 cm-1、1 653 cm-1处的振动吸收峰分别为-OH、-C=O 的振动吸收峰，3 016 cm-1的吸收峰是由于CH2基团的C-H 伸缩和弯曲振动所形成的，以上表明CTP中有多糖的特征吸收峰的存在。CTP-SeNPs 中-OH 拉伸震动形成的吸收峰和-C=O 吸收峰分别为3 430 cm-1、1 631 cm-1，表明CTP-SeNPs 中有多糖的存在。CTP-SeNPs 在2 858 cm-1附近的吸收峰与SeNPs 在2 854 cm-1附近的吸收峰类似，表明合成的CTP-SeNPs中有SeNPs 的存在。与CTP 相比，CTP-SeNPs 的-OH吸收峰从3 446 cm-1移至3 430 cm-1，C=O 吸收峰从1 653 cm-1移至1 631 cm-1，C-O-C 吸收峰从1 253 cm-1移至1 251 cm-1，均发生小幅度蓝移，推测SeNPs 的Se 原子与CTP 的O 原子相结合[14]。穆静静等[5]的研究中，普洱茶多糖-纳米硒的谱图中无新吸收峰产生，推测以天然多糖为模板制备多糖硒纳米颗粒时，天然粗多糖的多糖部分和蛋白质部分的-OH、-C=O 等基团通过非共价键的形式与硒原子结合，形成稳定的多糖-硒纳米颗粒复合物。前期[23,24]也有相似的研究报道。

图4 FT-IR 图谱分析Fig.4 FT-IR spectrum analysis

2.3.4 SEM-EDS 分析

扫描电镜观察CTP/CTP-SeNPs 的表观形态。图5a、5b 为藏黄连多糖在300 倍与1 200 倍下的扫描图，结果显示藏黄连多糖表面为片状，边缘呈针状；图5d、5e 为CTP-SeNPs 在300 倍和1 200 倍下的扫描图，结果显示Se 纳米颗粒子覆盖在CTP 表面，片状加厚，边缘圆润。CTP 和CTP-SeNPs 能谱结果，如图5c 和5f 所示，藏黄连多糖-硒纳米颗粒中Se 在五种元素（C、O、Se、S、Ca）中的质量百分数为11.66%。Xiao 等[25]报道冬虫夏草多糖-硒纳米颗粒中Se 的质量百分数仅为9.86%，Zhu 等[26]研究多糖-硒纳米颗粒中Se 的质量百分数为78.4%，而Chen 等[27]研究中的多糖-硒纳米颗粒中Se 的质量百分数为高达90.96%，由此，不同多糖-硒纳米颗粒中Se 的质量百分数不等，究其原因可能是多糖-硒纳米颗粒的制备方法以及多糖与硒纳米间的结合方式有关。本研究中藏黄连多糖-硒纳米颗粒的硒含量相对文献报道偏低，这有助于在应用藏黄连多糖-硒纳米颗粒时对硒含量的控制，避免过多的硒产生毒性作用而影响其生物活性。

图5 CTP 和CTP-SeNPs 的SEM-EDS 图谱Fig.5 SEM-EDS spectra of CTP and CTP-SeNPs

2.3.5 XRD 分析

如图6所示，CTP-SeNPs 的XRD 结果与标准Se比色卡（PDF：32-0992）对比，标准硒的2θ在24°和31°处有两个强烈的反射峰，表明硒的存在。CTP-SeNPs显示出与标准Se 有相似的反射峰，在前人的研究[25,28]结果中，多糖-硒纳米颗粒都表现出与Se 比色卡相似的强烈反射峰，表明CTP-SeNPs 中有Se 存在，CTP-SeNPs被合成成功。

图6 CTP-SeNPs 的XRD 分析Fig.6 XRD analysis of CTP-SeNPs

2.4 CTP 和CTP-SeNPs 体外抗氧化活性

2.4.1 ABTS+自由基清除实验

由图7a 可知，随CTP、CTP-SeNPs 浓度的升高，其对ABTS+自由基清除能力逐渐提高，且在10 mg/mL时达到最高为76.52%，而CTP 对ABTS+自由基清除能力与CTP-SeNPs 相比较弱，最高为54.98%，表明硒纳米颗粒子可以增强CTP 对ABTS+自由清除能力。抗坏血酸（Vc）为天然抗氧化剂、食品添加剂，常常作为抗氧化实验中的阳性对照；如图7a 结果所示，在同浓度下 Vc 清除 ABTS+自由基能力高于 CTP 和CTP-SeNPs。在Cai 等[29]的研究中，LRP-SeNPs（犀木多糖硒纳米颗粒子）的ABTS+自由基能力最大可达80%以上；Zhai 等[30]的研究中，CS-SeNPs（壳聚糖硒纳米颗粒子）的ABTS+自由基能力最大可达87.45%，均表现出较高的ABTS+自由基清除能力。

2.4.2 DPPH 自由基清除

由图7b 可知，当浓度为2～10 mg/mL 时，CTP-SeNPs 清除DPPH 自由基能力随着浓度的升高逐渐增加，且在10 mg/mL 时达到最高为66.85%，而CTP对DPPH 自由基清除能力与CTP-SeNPs 相比较弱，最高达到47.35%；如图7b 结果所示，在同浓度下Vc 清除DPPH 自由基能力高于CTP 和CTP-SeNPs。在Cai等[29]的研究中，LRP-SeNPs（犀木多糖硒纳米颗粒子）的DPPH 自由基能力最大可达50%以上；Zhai 等[30]的研究中，CS-SeNPs（壳聚糖硒纳米颗粒子）的DPPH自由基能力最大可达40%以上，硒可中断自由基链式反应以增强抗氧化活性，与CTP-SeNPs 的结果基本一致，表明硒纳米颗粒子可以增强CTP 对DPPH 自由清除能力。

2.4.3 羟自由基清除

由图7c 可知，各浓度CTP-SeNPs 均有清除羟自由基能力，随着浓度的升高，其对羟自由基清除能力逐渐增加，且在10 mg/mL 时达到最高为84.92%，而CTP对羟自由基清除能力与CTP-SeNPs 相比较弱，最高可达到62.29%；如图7c 结果所示，在同浓度下Vc 清除羟自由基能力高于CTP 和CTP-SeNPs。同样地，Mao等[31]研究表明硒纳米颗粒子可以增强灰树花菌多糖（GP）对羟自由基清除能力。

2.4.4 总还原能力

由图7d 可知，当浓度为6.0～10.0 mg/mL 时，CTP-SeNPs 总还原能力达到1 级以上，随着浓度的升高，总还原能力逐渐提高，且在10 mg/mL 时达到最高接近于2 级，而CTP 总还原能力弱于CTP-SeNPs，最高仅能达到1 级；Vc 同样表现出较高的抗氧化能力。Wu 等[32]的研究报告，果胶包封的SeNPs@Cur（包裹黄姜素的果胶硒纳米颗粒）可使果胶的总还原能力增强，出现这种现象可能是因为SeNPs 可以有效减少空间位阻，并改善姜黄素与二价铁络合物的反应，从而在结果中显示出最高的还原能力，该结果与CTP-SeNPs 一致，表明硒纳米颗粒子可以增强CTP 的还原性。

图7 CTP 和CTP-SeNPs 体外抗氧化Fig.7 CTP and CTP-SeNPs antioxidant activity in vitro

2.5 藏黄连多糖和CTP-SeNPs 体外试验

2.5.1 CTP 和CTP-SeNPs 细胞毒性

如图8所示，CTP 在500～1 000 μg/mL、CTP-SeNPs在250～500 μg/mL 浓度范围内均能显著促进RAW264.7的增殖；CTP-SeNPs 在1 000 μg/mL 浓度时，对RAW264.7 细胞的增殖作用显著下降，但并未表现出抑制作用，其原因是其中的硒纳米颗粒浓度也随之增大，表现出对多糖的促细胞增殖活性的抑制，但并未表现出毒性效果。Tamiru 等[33]研究报道，纳米形态的SeNPs不会影响硒的生物利用度，无机硒和SeNPs 均能升高硒诱导的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性和GPx1 转录水平，但无机硒（亚硒酸钠）的毒性可以通过其被还原为硒纳米颗粒子（SeNPs）来减轻。结合本研究数据，我们推测纳米态硒在一定浓度范围内对正常细胞具有促增殖效果，但当其浓度超过一定限度时，其可抑制与之结合的多糖的促细胞增殖活性，此时多糖与SeNPs 的已无协同作用。

图8 CTP 和CTP-SeNPs 体外刺激RAW264.7 细胞增殖Fig.8 CTP and CTP-SeNPs stimulate RAW264.7 cell proliferation in vitro

2.5.2 CTP 和CTP-SeNPs 抗炎活性

IL-6 是一种多效性细胞因子，可影响多种免疫和生理过程，如急性期蛋白生成、炎症、抗原特异性免疫反应[34]。在正常细胞中，IL-6 浓度非常低，在炎症条件下，IL-6 的浓度会急剧上升，而LPS 刺激下的细胞表现出IL-6 分泌升高，呈现炎症状态[35]。如图9a，与LPS 组相比，CTP 在浓度为1 000 μg/mL 时，显著缓解RAW264.7 细胞IL-6 的释放，表现出抗炎效果；而CTP-SeNPs 在250～1 000 μg/mL 范围内，均具有显著缓解炎症效果。同时，在250～1 000 μg/mL 浓度范围内，同一浓度时CTP-SeNPs 抗炎效果显著高于CTP，表明硒纳米颗粒可显著增强CTP 的抗炎效果。如图9b所示，CTP 在1 000 μg/mL 浓度时、CTP-SeNPs 在250～1 000 μg/mL 范围内均能显著促进LPS 刺激下的RAW264.7 细胞的增殖。由上可知，当细胞受到外源物质如LPS 刺激后，一定浓度的CTP-SeNPs 可诱导并启动细胞增殖和活性的恢复，从而缓解LPS 的刺激损伤，减少炎性因子IL-6 的释放，表现出较好的抗炎活性。

图9 CTP 和CTP-SeNPs 的抗炎活性Fig.9 The anti-inflammatory activities of CTP and CTP-SeNPs

3 结论

硒是人体和动物体必需的微量元素，然而其在机体中的有效剂量和中毒剂量十分接近，因此较难把握有效剂量，单质硒以纳米态存在时毒性较无机硒和天然有机硒有所降低，而生物活性较无机硒和天然有机硒有所提高。由于纳米硒尺寸小，表面能大，较易聚集成大颗粒，它的促细胞增殖作用和抗炎活性随着粒径的增加而逐渐降低，因此需要在纳米硒表面加以修饰，以阻止纳米颗粒子的聚集。多糖具有高度复杂的分支结构和活泼的羟基基团，能吸附和包裹还原反应中形成的纳米硒，进而阻止纳米硒颗粒的团聚，多糖亦具有良好的生物活性，是制备纳米硒的良好调控剂。

本研究从藏黄连中提取藏黄连多糖，用于合成藏黄连多糖-硒纳米颗粒，通过粒径分析、紫外光谱、红外光谱、SEM-EDS、XRD 试验对其进行了表征，结果表明藏黄连多糖可成功合成藏黄连多糖-硒纳米颗粒；通过DPPH 自由基清除、ABTS+自由基清除、羟自由基清除能力、总还原力试验测定了CTP 与CTP-SeNPs的体外抗氧化效果，结果表明，CTP-SeNPs 的体外抗氧化效果优于CTP，可能是硒纳米颗粒增强了藏黄连多糖的抗氧化能力。体外细胞毒性试验和抗炎试验表明，与CTP 相比，CTP-SeNPs 在250～500 μg/mL 范围内有显著的促细胞增殖作用，在250～1 000 μg/mL 范围内有显著的抗炎效果，硒纳米颗粒增强了藏黄连多糖的促细胞增殖和抗炎的效果，其抗炎效果的分子机制需待进一步研究。CTP-SeNPs 具有抗氧化、抗炎、低毒生物活性，可作为一种新型的富硒中药多糖保健品。