HMGB1、GM-CSF、LDH在慢性肺炎患儿中的表达及相关性研究

吴会芳，张景丽，刘晓娟，吴晓杰，段晨初，张中平

(河北省儿童医院呼吸三科，河北 石家庄 050031)

儿童慢性肺炎为病程迁延超过3个月的肺部炎症性疾病，因病情反复发作、治疗难度大，且患儿正处于生长发育期，对其生长发育造成了严重的影响[1]。研究发现，儿童慢性肺炎的发生伴有多种细胞因子的异常表达，了解相关因子在疾病发生发展中的作用，对于治疗方案的制定有重要指导作用[2-3]。在肺炎的发生发展过程中，炎性细胞因子造成的炎症浸润及过氧化氢等引起的氧化应激反应和细胞损伤是其重要病理特征[4]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一种新发现的炎症介质，被证实与肺炎支原体肺炎的发生发展有密切关系；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)在自身免疫及氧化应激调节方面有重要作用，参与炎症因子诱导的氧化应激及炎症损伤；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是与器官组织损伤密切相关的糖酵解酶，临床常用于疾病严重程度及预后的评价[5-6]。目前HMGB1、GM-CSF、LDH在儿童慢性肺炎中的变化仍未明确，本研究主要探究在慢性肺炎患儿中，外周血HMGB1与GM-CSF及LDH水平的表达及关系，为此类疾病的诊疗提供循征指导。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年3月—2020年3月收治入院的慢性肺炎患儿66例，为肺炎组。纳入标准：年龄3～14岁；符合《诸福棠实用儿科学》中对慢性肺炎的诊断[7]。排除标准：伴支气管扩张、肺结核、哮喘等其他呼吸道疾病者；存在其他组织及器官感染者、凝血功能障碍及免疫缺陷者；生命体征不稳定者。肺炎组中男性36例，女性30例，患儿年龄3～14岁，平均(8.62±2.25)岁；病程3～9个月，平均(6.09±1.32)个月，其中重症30例，轻症36例。另选取同期健康体检儿童80名，男性42名，女性38名，年龄3～14岁，平均(8.80±2.44)岁。2组受检儿童的性别、年龄比较，差异无统计学意义(P<0.05),具有可比性。

研究在实施前已经医院伦理委员会批准，且受检儿童家长均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集及检测 肺炎组儿童于入院当日抽取外周静脉血5 mL，对照组儿童于体检当日抽取，血液标本采集于未加抗凝剂的生化管中，以3 500 r/min离心5 min，半径12 cm，保存于-20 ℃备用。以抗体夹心酶联免疫吸附法检测HMGB1、GM-CSF：TMB显色，对标准品分别稀释为10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L浓度，设置空白孔、标准孔和样本孔，各浓度标准平中加样50 μL，样品稀释液和代检测样品为40 μL和10 μL，轻轻晃动使其混匀，封板膜封板，置于37 ℃环境下孵育0.5 h，洗涤(弃液体、甩干后添加洗涤液，静置30 s后弃液体，重复5次)，拍干后除空白孔外各反应孔加入新鲜稀释的酶标抗体50 μL，37 ℃环境下孵育0.5 h，洗涤，加底物显色液，37 ℃环境下避光显色10 min，于各反应孔中加入2 M硫酸50 μL，终止反应，在酶联免疫吸附测定仪上，空白孔调整为0，于450 nm波长处测量各孔的吸光度值，以Curve Expert软件分析，计算标准曲线的回归方程，样本OD值带入，计算样品实际浓度。以全自动分析仪速率法检测LDH水平。

1.2.2肺炎患儿病情严重程度及分组[8]重症肺炎诊断：合理应用大环内酯类抗生素超过7 d体温仍无明显变化，影像学检查提示存在肺叶高密度实变，存在肺不张、双肺广泛间质浸润、支气管扩张；合并胸腔积液/坏死性肺炎及肺脓肿等并发症。将符合重症肺炎诊断者纳入重症组，否则为轻症组。

1.3统计学方法 应用SPSS 26.0统计软件分析数据，计量资料采用独立样本t检验，Pearson相关性分析法进行HMGB1、GM-CSF、LDH的相关性评价，以受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)评价相关指标对疾病的评估价值，以曲线下面积(area under the curve，AUC)>0.7表示病情评估效能较好。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组的血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比较 肺炎组患儿血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 2组血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比较Table 1 Comparison of serum HMGB1, GM-CSF and LDH levels in two groups

2.2重症组与轻症组血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比较 66例患儿中30例符合对重症肺炎的判断，重症组的血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平均高于轻症组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 重症组与轻症组血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平比较Table 2 Comparison of serum HMGB1, GM-CSF and LDH levels between severe pneumonia group and mild pneumonia group

2.3肺炎组中血清HMGB1、GM-CSF、LDH的相关性分析 Pearson相关性分析显示，血清HMGB1与GM-CSF及LDH水平均呈正相关(P<0.05)，且LDH与GM-CSF水平呈正相关(P<0.05)。见表3,图1。

表3 血清HMGB1、GM-CSF、LDH的相关性分析Table 3 Correlation analysis of serum HMGB1, GM-CSF and LDH

图1 血清HMGB1与GM-CSF和LDH的Pearson相关性分析散点图

2.4HMGB1、GM-CSF、LDH对慢性肺炎患儿病情严重程度的评估价值 ROC曲线分析显示，获得最大约登指数时HMGB1、GM-CSF、LDH的最佳截断点分别为11.26 μg/L、16.89 μg/L、335.41 U/L，此时HMGB1、GM-CSF、LDH联合判断重症慢性肺炎的AUC为0.906，高于三者单独检测0.790、0.787和0.781，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图2。

表4 HMGB1、GM-CSF、LDH对慢性肺炎患儿病情严重程度的评估结果Table 4 Evaluation results of HMGB1, GM-CSF and LDH on severity of chronic pneumonia in children

图2 HMGB1、GM-CSF、LDH评估重症慢性肺炎的ROC曲线结果

3 讨 论

支气管发育异常、呼吸道异物、先天性心脏病、既往肺部疾病未痊愈及营养不良等多种因素均可造成儿童慢性肺炎，因该病的临床症状无明显的特异性，与普通的呼吸道感染症状相似，易被忽视而延误治疗[9]。慢性的肺部炎症可反复周期性发作，随着病程的延长逐渐累及内分泌、循环及消化等多个系统，增加并发症及肺源性心脏病发生风险，威胁患儿健康[10]。研究认为，炎症细胞因子的表达异常参与肺炎的发生发展中，且细胞因子作为实验室检测指标在病情的诊断及治疗方面有重要的指导意义[11]。故通过了解慢性肺炎患儿中异常表达细胞因子及与病情的相关性，对于指导治疗方案的制定有重要作用。

目前临床对于肺部炎症的诊断多使用白细胞计数、C反应蛋白等快速检测项目，虽可对炎症程度的判断有一定指导作用，但敏感性和特异性不慎理想，仍需寻求更加特异性指标。HMGB1是HGMB蛋白家族成员，主要存在于细胞核中，通过参与修复、转录和重组及基因组稳定性等维持细胞内环境稳定[12]。研究发现，单核巨噬细胞在白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等炎症介质刺激下，能使HMGB1从细胞核转移至胞浆，并以蛋白质非经典途径分泌至细胞外，成为炎症细胞因子，参与多种炎症和自身免疫性疾病的过程[13]。Le等[14]研究发现HMGB1参与肺巨噬细胞引起气道炎症和肺结构的破坏，提示HMGB1在肺炎的发生发展中有重要作用。GM-CSF是炎症因子和细胞脂多糖作用于多种细胞的产物，亦可在抗原刺激下由活化的免疫细胞分泌，具有造血和免疫调节作用，参与多种粒细胞功能的调节，包括肺泡巨噬细胞的分化[15]。研究表明，GM-CSF能趋化多种炎症细胞生成过氧化物酶，诱发氧化应激及炎症反应[16]。Bonaventura等[17]发现，包括GM-CSF等在内的炎症性细胞因子的增殖可驱动新型冠状病毒肺炎的肺损伤。LDH作为一种细胞质酶，广泛分布于心、肝、肺、淋巴等组织及器官中，几乎表达于所有类型细胞中，在器官和组织损伤后均可释放入血，即使有轻微的损伤，其所释放的LDH也可使血清中的水平明显升高，因此是非特异性且敏感性高的炎症标志物[18-19]。本研究结果显示，肺炎组的血清HMGB1、GM-CSF、LDH水平均高于对照组，且重症组水平均高于轻症组，提示HMGB1、GM-CSF、LDH参与儿童慢性肺炎的发生发展，具有儿童慢性肺炎感染性生物标志物的研究价值。

对HMGB1、GM-CSF、LDH判断儿童慢性肺炎的严重程度评估价值进行分析，发现三者的AUC分别为0.790、0.787和0.781，评估效能较高，而三者联合的AUC为0.906，高于单独评估，提示联合使用对儿童慢性肺炎的严重程度评估价值更高。研究表明HMGB1属于晚期炎症因子，具有免疫调节作用，被刺激活化的巨噬细胞、单核细胞、树突细胞等免疫细胞能分泌HMGB1，使其形成正反馈环，其在炎症反应中处于中心位置，能与多种受体结合引起细胞因子和趋化因子释放，维持长期炎症状态，符合慢性肺炎病情发展规律[20]。中性粒细胞及巨噬细胞等炎症细胞因子的聚集是肺部炎症损伤的重要病理特征，GM-CSF可受炎症细胞因子增殖驱动的影响，其水平的升高说明肺部处于炎症状态中[21]。黎明等[22]研究显示在难治性肺炎支原体肺炎治疗后GM-CSF较治疗前有明显下降，说明GM-CSF可反应病情变化，对肺炎病情判断有一定价值。LDH虽非是肺炎的特异性指标，但其对机体炎症有较高的敏感性，陈庆元等[23]认为，在支气管肺炎患儿中血清LDH与免疫功能相关，且与病情严重程度有关，对于疾病的发生进展及转归的判断有良好的价值。因此将HMGB1、GM-CSF、LDH联合检测对儿童慢性肺炎病情进行判断，能综合三项指标的生理病理判断优势，更好的反应肺部炎症损伤状态，对病情的客观评估有更高价值。

综上所述，慢性肺炎患儿存在外周血HMGB1、GM-CSF、LDH异常升高情况，且三者互为正相关，三者联合检测对于患儿肺部炎症程度的判断有更高的评估价值。本研究的不足之处在于慢性肺炎患儿的病情发生发展受多因素影响，HMGB1、GM-CSF、LDH仅对已发生病情作出评价，在疾病预防及筛查方面意义不大，后续计划从基因遗传方面探讨影响慢性肺炎的相关因素，为慢性肺炎的防治提供更有价值的参考。